Hydrodynamic Radius – Rayon de giration

La taille est importante : Rayon hydrodynamique Vs Rayon de giration (Rh contre Rg)

Bienvenue dans le deuxième épisode de la série de blogs faisant suite à notre webinaire C&EN réussi sur les analyses qualitatives et quantitatives des protéines.

Dans cette série de blogs, nous abordons certaines des questions intéressantes posées par les membres de l’audience. Aujourd’hui, nous examinerons la différence entre le rayon hydrodynamique (Rh) et le rayon de giration (Rg), et ce qu’ils signifient pour la caractérisation des protéines.

Parmi les nombreux paramètres qui décrivent la taille d’une molécule, les deux plus couramment utilisés sont le rayon hydrodynamique (Rh) et le rayon de giration (Rg). Tous deux vous indiqueront si votre molécule est grande ou petite, mais utilisent des moyens différents pour parvenir à une valeur de taille… et, peut-être plus déroutant, leurs réponses ne seront pas les mêmes, et pourtant aucune n’est mauvaise !

Rh, tel que mesuré par diffusion dynamique de la lumière, est défini comme le rayon d’une sphère dure équivalente diffusant à la même vitesse que la molécule observée. En réalité, les solutions de protéines et de leurs complexes n’existent pas en tant que sphères dures et donc, le rayon hydrodynamique déterminé reflète plus précisément la taille apparente adoptée par la molécule solvée et en rotation. D’autre part, Rg est défini comme la distance moyenne pondérée en masse du noyau d’une molécule à chaque élément de masse dans la molécule. Pour les macromolécules ayant des rayons supérieurs à 10 nm, Rg est classiquement déterminé en utilisant la diffusion de la lumière multi-angle ; une technique qui repose sur la mesure d’une différence de l’intensité de la lumière diffusée à différents angles ou autrement connu comme dépendance angulaire. Les molécules avec des rayons inférieurs à 10 nm – représentant la majorité des protéines connues – diffusent la lumière uniformément à tous les angles (diffuseurs de Rayleigh) et ne présentent donc pas de dépendance angulaire. En conséquence, Rg ne peut pas être déterminé pour les protéines de cette manière. Il est toutefois possible d’obtenir Rg pour les protéines et les petites molécules en utilisant d’autres techniques telles que la diffusion de neutrons aux petits angles (SANS) et la diffusion de rayons X aux petits angles (SAXS) ou à partir de structures de rayons X à haute résolution.

Pour les protéines et leurs complexes, Rg et Rh seront toujours du même ordre de grandeur, mais que signifient réellement ces paramètres de taille pour la caractérisation des protéines ?

Pour répondre à cette question, nous devons examiner trois domaines clés de la caractérisation des protéines. Tout d’abord, pouvoir mesurer la taille offre un moyen simple de confirmer l’identité et l’état oligomérique d’une protéine dans une préparation, étant donné la connaissance a priori de sa taille monomérique. Ainsi, il est facile de voir comment le dépistage par taille peut être mis en œuvre dans les laboratoires de production de protéines pour identifier les fractions pertinentes de protéines purifiées ou pour vérifier la cohérence de lot en lot des formulations.

Deuxièmement, les processus biologiques se produisent en solution ; par conséquent, l’intérêt d’étudier et de caractériser les protéines est fermement enraciné dans la compréhension, et finalement le contrôle, du comportement des protéines. On pense que si l’on comprend le comportement des protéines en solution, alors les interactions avec d’autres biomolécules, médicaments et entre elles peuvent être prédites. Cette information peut ensuite être poussée un peu plus loin et utilisée pour manipuler les solutions de protéines afin de provoquer un résultat spécifique, par exemple, le développement de formulations. De cela, il est clair que Rh est un paramètre biologiquement pertinent puisqu’il considère la taille de la protéine dans le contexte de son environnement.

Rg et Rh peuvent tous deux être utilisés pour acquérir des informations sur le troisième domaine clé de la caractérisation des protéines : la structure. La façon dont Rg est calculé signifie que la valeur elle-même dépend légèrement plus de la structure de la molécule d’intérêt que la valeur de Rh. Mais c’est le rapport Rg/Rh (Rg/Rh) qui fournit réellement des informations sur la forme d’une molécule protéique. La valeur caractéristique de Rg/Rh pour une protéine globulaire est d’environ 0.775, ce qui signifie que Rg est plus petit que Rh. Cependant, lorsque des molécules dévient de globulaires à des structures non sphériques ou allongées, alors Rg/Rh tend vers des valeurs supérieures à 0.775, car Rg devient plus grand que Rh.

Expérimentalement, il est important de rappeler que pour les protéines Rg ne peut pas être obtenu par des techniques de diffusion statique de la lumière et que Rh peut offrir un itinéraire alternatif vers des informations sur la forme grâce à la théorie de Perrin.

En résumé, les valeurs de Rg et Rh ne doivent pas être utilisées à la place l’une de l’autre, mais chacune donne une perspective différente de la protéine en question. En plus de la valeur des informations fournies par la taille moléculaire, de nombreuses caractéristiques de la mesure elle-même devront être examinées, par exemple le temps d’analyse, la concentration, le volume de l’échantillon, le budget, afin d’établir la véritable valeur pour l’utilisateur.

Bientôt disponible…

Gardez un œil sur le prochain épisode de cette série de blogs où nous mettrons en lumière le point d’agrégation et comment il est lié à la stabilité des protéines et des formulations biothérapeutiques.