Le chemin vers le maître du calorimètre, Vol.8
Mesurons la RNase A par DSC ! Partie 2

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Les personnages et l’histoire présentés ici sont fictifs.
Pour le contenu technique, nous avons reçu des conseils de Prof. Fukada, chercheur invité à l’Université Préfectorale d’Osaka.

Le bouton « Télécharger » en bas de page permet de télécharger
la procédure d’analyse VP-DSC mentionnée dans le texte.

(Continuer de la partie 1

La ligne de base de la mesure de contrôle est stable. Dès qu’elle atteint environ 30°C, vous pouvez retirer le capuchon de pression, remplir l’échantillon, utiliser ThermoVac pour dégazer avec le minuteur. Après le dégazement, retirez le capuchon de pression et placez le bouchon de pression sur le capteur. Cette fois-ci, sans utiliser d’entonnoir de remplissage, connectez une aiguille avec une seringue à embout Luer à la cellule, en veillant à ne pas toucher le fond, pour vider le tampon de la cellule échantillon. Remplissage de l’échantillon dégazé terminé. Au bout des 15 minutes de thermorégulation PreScan, c’est la fin de l’équilibrage. La valeur DP tend vers zéro, donc ça va !

M. Nakamura. Tout va bien ?

	Oui, la valeur DP semble bonne aussi. Il ne reste plus qu’à attendre les résultats de la mesure.

À propos, avez-vous changé le Number of Scans ?

	Oh, je l’ai oublié. Il faut changer le nombre à 11 et cliquer sur Update Run Param. Ouf, c’était limite.

	Pas de problème, même après le début de la mesure. Mais il est toujours rassurant de le faire à l’avance pour éviter les problèmes potentiels pendant la prise de données.

Je garderai cela à l’esprit.

	Vous avez obtenu de bonnes données, M. Nakamura.

Merci beaucoup. Mais la ligne de fond est en hausse. C’était aussi le cas pour la mesure eau-eau. Est-ce un problème ?

	Cette pente est attribuée à un léger déséquilibre du volume entre la cellule échantillon et la cellule de référence, généralement inévitable et induit par le système. Cependant, dans une expérience DSC, les données du contrôle sont toujours soustraites des données de l’échantillon, donc tout comportement similaire entraîne une annulation.

Donc, la qualité des données est déterminée par la concordance de cette pente de la ligne de fond, n’est-ce pas ?

	C’est exact.

Si la pente ne concorde pas, cela pourrait être dû à l’entrée de bulles d’air dans la cellule ?

	Exactement. Si la reproductibilité de la ligne de base est médiocre, il est important de vérifier les bulles d’air, souvent causées par des cellules sales.

	Il est crucial de maintenir les cellules propres pour ITC comme pour DSC !

	Oui, la propreté des cellules est cruciale. Si la composition du tampon change, cela peut aussi entraîner une dérive de la ligne de base. Faites attention à cela.

	Encore un point important. Il est crucial de voir que la réponse de l’échantillon est en dessous de celle du contrôle. Si oui, c’est bon.

Oui, pourquoi est-ce ?

	Comparativement au contrôle, le tampon, l’échantillon contenant des protéines a une molarité en eau plus faible. Par rapport à l’eau, la capacité calorifique de la protéine est moindre, d’où une production de chaleur plus faible.

Je vois. Et si néanmoins le signal de l’échantillon sort plus haut, quelle serait l’hypothèse ?

	Cela peut se produire si la composition du tampon diffère légèrement.

	Pour finir, nettoyons et éteignons le système.

Bien joué. Il est temps de procéder à l’analyse.

	Oui, j’essaierai de suivre le manuel pour commencer.

Tiens, l’icône manque sur le bureau…

	Il se pourrait que selon l’instant d’achat, votre bureau n’ait pas l’icône MicroCal, LLC DSC mais ait MicroCal Analysis Launcher. Dans ce cas, double-cliquez cette icône puis choisissez VP-DSC après avoir cliqué sur MicroCal Data Analysis Click button to Start. La suite suit le manuel.

Alors, quel contrôle parmi les 10 scans choisir ? Normalement, on choisit le plus proche du scan de l’échantillon, pas vrai ?

M. Nakamura, un problème ?

Parmi les 10 scans de contrôle, devrais-je choisir le 10ème qui est le plus proche de l’échantillon ?

Effectivement. Plus les scans sont répétés, mieux leur reproductibilité. Autant utiliser le 10ème scan, sauf en cas de bruit dans la dernière mesure de contrôle.

	Bien, je vais appeler le 11ème scan pour l’échantillon et le 10ème pour le contrôle.
	Note : Bien que l’analyse indique Kcal/mole, il s’agit bien de kcal/mol.

M. Nakamura, l’analyse semble bien partie.

C’est le cas, mais ΔH ressort avec deux valeurs. Les valeurs sont proches, laquelle choisir ?

M. Nakamura, cela avait été une question dernièrement, non ?

???

Les différences entre l’enthalpie calorimétrique (ΔHcal) et l’enthalpie de van’t Hoff (ΔHvh).

	Oh, je l’avais oublié !

L’enthalpie avec un « v » sous Δ est celle de van’t Hoff. La proximité des résultats indique que RNase A subit une transition à deux états.

En effet. Un tel échantillon peut être analysé par le modèle à deux états.

	Par ailleurs. Le Test Kit mentionne « data analysis method: Integrate from 0 ». Que signifie-t-il ?

Le logiciel propose cette méthode pour déterminer les changements d’enthalpie et de Tm après soustraction du pic de la ligne de base.

	En complément, « Integrate from 0 » n’est pas dans le manuel japonais simplifié. Après édition des données pour ajustement, les étapes restent similaires jusqu’à la soustraction de la ligne de base. Voici les étapes postérieures.

Surprise ! Tm et NDH diffèrent des valeurs ajustées !

	Integrate from 0 mesure un Tm de sommet par rapport à une moitié d’aire sous courbe pour l’ajustement, provoquant une légère variation avec NDH calculé, et si l’ajustement n’est pas parfait, il y a décalage.

Exact. Quelle est la latitude acceptée face aux variations ?

J’ai appris de Malvern qu’un SE inférieur à 2% est correct.

ΔH est à 1.026E5 cal/mol (1.02 kcal/mol), donc 2% c’est 2052 cal/mol ; 409 cal/mol est acceptable.

C’est cela.

En complément, la dernière question de M. Nakamura était sur l’usage de modèles d’ajustement ou non, choix laissé à l’utilisateur. En cas de transition à deux états, les résultats sont similaires entre ajustement et Integrate from 0 car de tels échantillons tendent à donner des pics symétriques, donc Tm est proche du sommet de pic. Cependant pour des transitions non-bipolaires, ce n’est pas toujours le cas. La constance dans votre méthode d’analyse est primordiale.

Le bouton « Télécharger » ci-dessous vous permet de télécharger la procédure « VP-DSC data analysis » mentionnée dans le texte.
(C’est identique à celui téléchargeable depuis la partie 1.)

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