Le chemin vers la maîtrise du calorimètre Vol.2 suite
Utilisons le calorimètre isotherme à titrage iTC200 !
※À la fin de cet article, vous pourrez télécharger les documents.
Enfin, Nakamura a rendu visite au professeur Fukada. 
Professeur Fukada ! Ça fait longtemps !! Vous allez bien ?
Nakamura, vous êtes enfin là. Je vous attendais. Cela fait combien d’années ?Haha. Il paraît que vous allez commencer à utiliser l’ITC et le DSC.
Oui, c’est ça ! Merci de m’aider. Bien que je savais que vous faisiez des mesures quand j’étais étudiant, je n’aurais jamais pensé le faire moi-même un jour.
Hahaha. C’est la vie. Par où voulez-vous commencer ?
J’ai essayé de faire des mesures avec l’iTC au travail, mais je n’y suis pas vraiment arrivé… J’ai donc rassemblé quelques questions.
Ah, vous êtes bien préparé. Allons voir cela.
Le professeur Fukada a vérifié les notes de Nakamura.
Nakamura, cela fait-il longtemps que vous n’avez pas utilisé le système ?
Un DP élevé et un niveau de bruit de la ligne de base élevé en sont les signes.
Changer l’eau de la cellule de référence n’a pas aidé, n’est-ce pas ?
Je pense qu’il est nécessaire de procéder à un nettoyage minutieux.
De plus, le nettoyage sera très important à l’avenir.
De mon côté, je nettoie la cellule et la seringue avec du détergent et de l’eau ultrapure à chaque mesure.
Donc, si le DP est supérieur à celui de la Poudre de référence, ce n’est pas à cause des bulles mais bien car la cellule échantillon est sale.
Ah, le voilà ! (Manuel P41 et (note 1))
(note 1) Les utilisateurs de VP-ITC doivent se référer au manuel, page 45. Pour changer la température de la jaquette, entrez la température dans Set Point (°C) sous l’onglet Thermstat/Calib., puis cliquez sur Set Jacket Temp.
Professeur, lorsque le DP est faible, je pense que des bulles d’air sont entrées dans la cellule échantillon. Comment éviter qu’elles ne pénètrent ?
Lorsque vous injectez la solution, prenez un peu plus (350 μL) avec la seringue et insérez-la lentement tout en rapprochant le plus possible l’aiguille du fond de la cellule. Habituellement, cela fonctionne, mais quand vous avez une petite quantité de solution, disons environ 50 μL, faites un pompage pour créer une convection dans la cellule et chasser les bulles d’air. La quantité de liquide dans le tube menant à la cellule est d’environ 50 μL, donc un pompage au-delà pourrait réintroduire des bulles après les avoir chassées, donc faites attention.
Aussi, en agitant doucement la seringue de haut en bas dans la cellule, vous pouvez libérer les bulles piégées à la jonction de la cellule et du conduit.
Un autre point important ! Si la température de la solution est inférieure à celle de la mesure, ajustez-la à celle de la mesure. Pour l’iTC200, le dégazage de l’échantillon n’est normalement pas nécessaire (note 2) selon le fabricant.
À force de répéter les mesures, vous attraperez le coup de main, alors continuez avec patience.
(note 2) Pour les utilisateurs de VP-ITC, effectuez un dégazage avant mesure.
Et, au sujet de la référence, pourquoi l’eau ultrapure suffit-elle ? Normalement dans les expériences, il faut équilibrer les buffers, non ?
La cellule de référence doit contenir une solution avec la même capacité thermique que la cellule échantillon pour annuler les fluctuations de température externes. La capacité thermique de l’eau est très élevée et parmi les solutions, l’eau est majoritaire, non ? Donc, l’eau suffit pour la cellule de référence, pas besoin de buffer.
L’eau dans la référence doit être changée une fois par semaine, cela suffit, mais elle s’évapore légèrement, alors changez-la si vous faites des mesures à haute température souvent.
Ah, je vois, c’est comme ça.
Professeur, une dernière question ?
Demandez autant que vous voulez.
Merci beaucoup ! À propos des réglages de concentration lors de la mesure réelle, selon le manuel on parle de baser cela sur une valeur C, mais je n’ai pas saisi l’idée.
Permettez-moi d’expliquer. La valeur C guide pour déterminer la concentration échantillon de cellule nécessaire pour obtenir une courbe sigmoïdale de qualité lors de l’analyse.
L’iTC200 est livré avec un logiciel de simulation dans son logiciel de contrôle, donc vous pouvez l’utiliser pour simplifier le réglage des conditions.Habituellement, la concentration en protéines est d’environ 10 μM, mais cela varie selon la force de liaison, soyez prudent.
Lors du réglage en fonction de la valeur C, pour des interactions à haute affinité, la concentration cellulaire peut devenir très basse.
Par exemple, avec un échantillon ayant une constante de dissociation de 10 nM, si vous essayez de maintenir la valeur C à 5, 
vous pouvez calculer que 50 nM est la concentration de cellule.
Mais si vous faites effectivement une mesure à cette concentration, vous risquez de ne pas obtenir suffisamment de chaleur, alors il est préférable d’avoir au moins 1 μM (note 3).
Pour les mesures ITC, une information de concentration précise est cruciale, mais nous en parlerons une prochaine fois. Pour le moment, il est conseillé que la concentration de protéines soit déterminée par le spectre d’absorption UV autour de 280 nm.
Faisons une mesure réelle maintenant. Commençons par une pratique avec CaCl2 et EDTA.
(note 3) Les changements de chaleur résultant d’interactions varient, il est parfois suffisant à 1 μM, et si le changement est faible, il faut augmenter la concentration cellulaire.
Prochainement, en regardant les données obtenues, nous apprendrons les points d’attention lors de l’analyse des données, ainsi que les solutions aux problèmes potentiels.
Attendez-vous à cela !
Pour faire ce blog, afin qu’il soit réaliste, nous avons observé une session réelle de mesure ITC avec le professeur Fukada.
Le système utilisé était un système OMEGA, mis en vente en 1987. J’étais surpris de voir ce système vieux de presque 30 ans toujours en service actif. C’était la première fois que je le voyais fonctionner. L’ordinateur utilisé était toujours sous Windows 3.1 !? Aucun port USB, évidemment. Mais ce qui était le plus surprenant, c’est que la cellule du système n’a jamais eu de panne, et seulement le moteur d’agitation et la carte PC ont été réparés.
Le professeur Fukada comprenait bien le système et avait inventé ses propres méthodes d’utilisation, non mentionnées dans le manuel. Et comme prévu, un nettoyage rigoureux après chaque mesure était effectué.
En incorporant les techniques transmises par le professeur, nous nous efforcerons de continuer à partager des informations utiles avec vous.
Pour l’histoire des ITC MicroCal, consultez le blog de Malvern Royaume-Uni. Voici le blog de material talks !
