Sur la voie pour devenir maître en calorimètre Vol.4 Optimisons nos expériences ITC ! Suite

Essayons maintenant de mesurer les protéines et les composés. Comme nous ne connaissons pas encore l’affinité, essayons de mesurer les protéines à 10 μM et les composés à 100 μM de manière conventionnelle.

Cela ne dessine pas une courbe sigmoïde. Peut-être que la concentration est mal réglée… La chaleur de dilution du contrôle est à peu près la même pour chaque titrage. La valeur DP est de 0.015 μcal/sec, c’est donc faible, non ? De plus, elle est inférieure à la quantité de chaleur à la dernière titration de l’échantillon. Cela signifie que la production de chaleur de l’échantillon est très faible. Est-ce que c’est bien de juste déduire cela… ?

Monsieur Nakamura, il semble que vous avez des difficultés.

Monsieur Fukada, en effet. J’ai mesuré les protéines et les composés, mais cela ne dessine pas une courbe sigmoïde et la quantité de chaleur obtenue semble très faible.

Je vois. Monsieur Nakamura, avez-vous essayé d’utiliser le logiciel de simulation avant la mesure ?

Ah, c’est ce qui est inclus dans le logiciel de contrôle de l’iTC200, dont vous parliez auparavant. Désolé, je ne l’ai pas utilisé…

C’est écrit dans le manuel. Pourquoi ne pas consulter la page 39 ?

D’accord, je vais vérifier.

En outre, l’échantillon mesuré cette fois semble avoir une affinité relativement faible.

Oui, je crois que c’est à peu près quelques μM.

Comment ont été définies les concentrations ?

J’ai mis les protéines à 10 μM et les composés à 100 μM.

Alors, que se passe-t-il si vous simulez en supposant que K_D est de 5 μM ?

Oh, cela dessine une sigmoïde. Toutefois, les concentrations sont définies plus haut que celles que j’ai utilisées.

C’est ça. C’est la concentration recommandée par le logiciel de simulation. Alors, que se passe-t-il si vous simulez avec les concentrations que vous avez utilisées ?

Protéines à 10 μM, composés à 100 μM donc…

Oh ! Cela ne dessine pas de courbe sigmoïde !!

Oui. Dans les cas comme celui-ci, si vous connaissez la K_D prévisible, je pense qu’il serait bon de simuler et de vérifier avant de procéder à la mesure réelle.

Je comprends. Le logiciel de simulation est pratique !

Alors, je vous pose une question. Voici les données mesurées par ITC pour une interaction de faible molécule, Sulfanilimide et AMBSA, avec l’anhydrase carbonique bovine. Que pensez-vous en regardant ces données ?

Dans le graphique de Sulfanilimide ci-dessus, cela semble dessiner une courbe sigmoïde, mais dans le graphique d’AMBSA ci-dessous, c’est linéaire et ne semble pas dessiner une courbe sigmoïde.

Oui. Alors, que pensez-vous qu’il faille faire pour provoquer le dessin d’une courbe sigmoïde ?

Hum… la dernière fois, nous avons abaissé la concentration et n’avons pas pu dessiner une courbe sigmoïde, devrions-nous plutôt augmenter la concentration ?

Exactement. À propos, on dit que le K_D de Sulfanilimide est d’environ 8 μM et que celui d’AMBSA est de 10 μM.

Je vais essayer de simuler cela.

À la concentration dans le précédent graphique, la concentration n’était pas suffisante pour dessiner une courbe sigmoïde. Cependant, professeur, dans les résultats de la simulation, la concentration des cellules est définie relativement élevée. Que devrions-nous faire si nous ne pouvons pas reproduire ces concentrations ?

Monsieur Nakamura, vous souvenez-vous de l’intervalle de réglage de la valeur C ?

L’intervalle de réglage ?

Consultez le manuel. Quelle était la plage idéale écrite dedans ?

Ah ! C’était idéal à 5–250 et acceptable à 1–1000. (Veuillez consulter le manuel simplifié en japonais P.7–8)

Exactement. Dans le logiciel de simulation, vous pouvez également changer la valeur C. Vous pouvez également simuler ce qu’il se passerait si vous mesuriez avec les concentrations d’échantillons réellement préparées.

Compris ! C’est un design expérimental.

C’est exact. Au-delà des manuels, Monsieur Nakamura, dans le futur, vous pourriez mesurer des composés avec encore moins d’affinité, je vais donc vous enseigner les points clés de cette mesure et analyse.

Oui, merci de me l’apprendre !!

Que pensez-vous de ces données, Monsieur Nakamura ? C’est l’interaction entre une protéine et un fragment…

Cela ne dessine pas une sigmoïde, donc nous allons essayer de mesurer en augmentant la concentration, n’est-ce pas ?

Si cet essai avait été effectué avec des concentrations de protéines de 30 μM et de 3 mM pour le fragment, que se passerait-il ?

Quoi ? La concentration de fragment est aussi élevée ? Tandis que la concentration de la protéine en cellule n’est pas si haute…

Alors, retournez au manuel. Consultez la P.9. C’est pourquoi vous devez concevoir une configuration d’expérience pour des affinités supposées faibles de 100 μM.

Cela ne dessine pas une sigmoïde.

Exactement. Si l’affinité est très faible, il est probable qu’un réglage de concentration qui force une courbe sigmoïde entraîne une incohérence. Pouvez-vous simuler cela?

Oh là là ! 1 mM de protéine est impossible !!

Exactement. Dans ce genre de cas, comme indiqué dans le manuel, vous devez définir la concentration de la protéine à 1/5–1/100 du K_D prévu, mais vous devez aussi vous assurer d’au moins 10 μM. Pour l’échantillon de titrage, environ 10–50 fois le K_D et quelques mM sont nécessaires. Dans les titrages finaux de mesure, il faut régler pour que les protéines soient complètement saturées. Regardez l’axe x de la normalisation des données de tracé du rapport molaire dans les données précédentes. Vous voyez des valeurs élevées, n’est-ce pas ?

Oui. Mais il semble que cela ne devienne pas une sigmoïde…

Oui. Dans l’état actuel des choses, il est impossible de déterminer le rapport de liaison ou les changements d’enthalpie. Par conséquent, il est nécessaire d’ajouter un peu de finesse à l’analyse.

Un peu de finesse ??

Oui, exactement. Comme indiqué dans le manuel, nous analysons en présumant la « valeur du rapport de liaison ». Si l’échantillon que vous mesurez montre une liaison 1:1, vous pouvez raisonnablement supposer que le rapport de liaison sera « 1 », n’est-ce pas ?

Théoriquement, oui…

Le rapport de liaison est le point médian sur la courbe sigmoïde, donc lors du paramétrage initial pour le fitting, entrez « 1 » comme une constante pour les calculs. Cela peut être fait en saisissant « 1 » pour la valeur N et en décochant « Vary? » (qui indique un changement) dans la fenêtre de session de fitting. De cette façon, le logiciel d’analyse utilise une portion de la courbe sigmoïde réelle et simule une courbe sigmoïde ayant le rapport molaire de 1 à ce point d’inflexion. En conséquence, vous pouvez déterminer K_D et ΔH.

Je vois !

Notez que cela est basé sur l’hypothèse que la concentration de votre échantillon conserve 100 % de son activité.

Oui !

Ainsi, Monsieur Nakamura a pu effectuer des mesures sur un échantillon réel. Il a appris qu’il y a des préparations d’échantillons adaptées aux propriétés de chaque échantillon, des conditions de mesure et des méthodes d’analyse. Lorsqu’on obtient une réaction irrégulière, au lieu de forcer une analyse erronée, il est important de se demander comment cela aurait dû se passer, et pourquoi cela ne s’est pas passé ainsi. Dans l’article suivant, nous prévoyons de vous présenter l’interprétation et la façon de réagir lorsque des données inhabituelles sont obtenues.
Prochain poste, nous allons traiter de l’interprétation et de la gestion des données irrégulières lorsque des résultats curieux apparaissent.

【Post-scriptum du blog】
Avez-vous deviné quelle est la question la plus fréquemment posée dans les requêtes ITC ? La réponse est « Le liquide ne s’écoule pas lors du nettoyage de la seringue de titrage ». Pour plus de détails, veuillez vous référer à vol.2 sur la voie du maître en calorimètre.

Sont mentionnés, la cassure de la partie en verre de la seringue de titrage, le mauvais raccord de l’adaptateur de port de remplissage, la détérioration de l’O-ring, mais récemment, il y a eu des cas où un défaut est causé par une autre raison…

C’est l’obstruction du filtre situé à l’arrière du module de lavage.

En remplaçant ce filtre, il est possible de résoudre les dysfonctionnements. Si les problèmes ne sont pas résolus selon les instructions « Comment remédier au problème d’absence de flux d’eau de nettoyage dans la seringue de titrage MicroCal iTC200 », veuillez essayer de remplacer ce filtre. Notez que le filtre est inclus lors de la fourniture du système.

Cependant, selon la période de livraison du système, il est possible que ce filtre soit installé à l’intérieur du module de lavage et qu’il ne soit pas visible, comme sur la photo. Dans ce cas, l’échange par le client est difficile, nous vous prions donc de contacter le personnel technique de notre société.