Quel détecteur de diffusion de la lumière est le meilleur pour moi ?

Déterminer quel système de chromatographie par perméation de gel/chromatographie d’exclusion de taille (GPC/SEC) est le meilleur pour vos besoins peut être une tâche décourageante. Même après avoir décidé d’inclure un détecteur de la diffusion de la lumière pour obtenir des données de masse moléculaire absolue, il vous reste à choisir entre deux options : un détecteur de diffusion de la lumière à angles multiples (MALS) ou un détecteur de diffusion de la lumière à angle droit et à angle faible (RALS/LALS). Les deux configurations de diffusion de la lumière fourniront la masse moléculaire absolue d’un échantillon mais utilisent des approches différentes pour atteindre cet objectif commun. Heureusement, Malvern Panalytical offre les deux ; l’unité modulaire SEC-MALS 20 qui peut se connecter à OMNISEC, le TDAmax, ou d’autres systèmes tiers, et un détecteur intégré RALS/LALS dans les systèmes GPC/SEC tout-en-un OMNISEC et TDAmax. Dans cet article, je discuterai des détecteurs MALS et RALS/LALS et j’espère fournir les informations pertinentes qui vous permettront de déterminer quelle configuration est la meilleure pour vous et votre application.

Pour commencer, nous allons prendre un peu de recul et discuter brièvement de certaines théories de la diffusion de la lumière (pour une discussion plus détaillée sur la diffusion statique de la lumière, veuillez consulter notre livre blanc précédemment publié sur le sujet). La raison pour laquelle les détecteurs de diffusion de la lumière fonctionnent est que l’intensité de la lumière diffusée par une molécule est directement proportionnelle à sa masse moléculaire. Plus la masse moléculaire est élevée, plus l’intensité de la lumière diffusée est grande. Cette relation est soulignée par l’équation de Rayleigh, présentée ci-dessous, où RΘ représente l’intensité de la lumière diffusée à un angle donné Θ et Mw est la masse moléculaire d’un échantillon.

En outre, l’angle d’observation de la lumière diffusée joue un rôle. Les échantillons relativement petits avec un rayon de 10-15 nm ou moins sont connus comme des diffuseurs isotropes, ce qui signifie qu’ils diffusent la lumière de manière uniforme dans toutes les directions. Cela signifie que l’intensité de la lumière observée au détecteur à 90° est la même que l’intensité de la lumière observée à un détecteur placé à 15°, 45°, 135°, etc. Les échantillons plus grands que cette plage de 10-15 nm sont affectés par l’interférence, car l’échantillon est assez grand pour diffuser la lumière plusieurs fois avant qu’elle n’atteigne le détecteur. Le résultat est que l’intensité de la lumière diffusée par les grands échantillons varie en fonction de l’angle d’observation. La dépendance angulaire de l’intensité de la lumière diffusée signifie que différentes masses moléculaires pourraient être calculées en fonction du positionnement du détecteur. Pour minimiser les effets de l’interférence, l’angle d’observation optimal pour l’intensité de la lumière diffusée par les grands échantillons est l’angle de 0°. D’un point de vue pratique, cela est impossible, car le détecteur serait incapable de distinguer la lumière diffusée par l’échantillon de celle du faisceau incident. Les solutions à ce problème – observer l’intensité de la lumière diffusée à l’angle de 0° – sont représentées par les configurations de détecteurs MALS et RALS/LALS.

Un détecteur MALS utilise généralement entre trois et vingt détecteurs disposés à divers angles autour de la cellule d’écoulement de l’échantillon. Un détecteur à 90° est généralement inclus, et les autres détecteurs peuvent aller de 12° à 168°. Un détecteur MALS effectue des mesures de lumière diffusée à une variété d’angles, ajuste les données à un modèle et extrapole à 0° pour déterminer la masse moléculaire de l’échantillon. Si l’échantillon est un diffuseur isotrope, alors chaque point de données représentera la même intensité de diffusion et l’extrapolation à 0° sera une ligne plate. Si l’échantillon est assez grand pour montrer une dépendance angulaire, alors les différences d’intensité de la lumière diffusée en fonction de l’angle d’observation deviendront apparentes. Les deux exemples sont présentés dans les graphiques Zimm partiels ci-dessous.

Graphiques Zimm partiels montrant divers angles d’une réponse MALS ; Gauche : un échantillon montrant une diffusion isotrope avec la même intensité à tous les angles ; Droite : un échantillon montrant une dépendance angulaire, comme en témoigne la pente du graphique

L’arrangement de détecteurs RALS/LALS est composé de détecteurs à 90° et 7°, judicieusement choisis en raison de leur nature complémentaire. Pour les échantillons de 10-15 nm de rayon et plus petits, le détecteur à 90° est idéal car il est situé à angle droit par rapport au faisceau incident, ce qui maximise le rapport signal sur bruit. Comme les petits échantillons diffusent la lumière avec la même intensité dans toutes les directions, le détecteur RALS offre la réponse idéale pour une mesure directe de la masse moléculaire d’un échantillon. Pour les échantillons d’un rayon supérieur à cette plage de 10-15 nm qui présentent une dépendance angulaire, le détecteur LALS fournit une mesure à 7°, qui est la position de détecteur la plus basse disponible. Le positionnement à 7° signifie que le détecteur effectue essentiellement une mesure directe de la masse moléculaire de l’échantillon et évite le besoin de tout ajustement et extrapolation. Il est important de noter que le détecteur LALS est précis pour les échantillons de toutes tailles, cependant, en raison de la faible intensité de la lumière diffusée par les petits échantillons de faible masse moléculaire, le RALS fournit un signal plus propre du fait de son positionnement orthogonal par rapport à la source lumineuse incidente.

Graphiques Zimm partiels montrant la mesure directe de la masse moléculaire ; Gauche : la réponse RALS à 90° pour la mesure d’un échantillon montrant une diffusion isotrope ; Droite : la réponse LALS à 7° pour la mesure d’un échantillon montrant une dépendance angulaire

Pour déterminer le détecteur de diffusion de la lumière le plus approprié pour vos besoins, vous devez prendre en compte votre application, les informations que vous recherchez, et votre préférence personnelle. Les deux détecteurs MALS et RALS/LALS ont des avantages et des inconvénients qui peuvent les rendre plus adaptés à une situation ou une autre, mais la bonne nouvelle est qu’ils peuvent tous deux être comptés pour fournir des résultats précis !

Par exemple, si votre principal objectif d’analyse est un échantillon relativement grand de haute masse moléculaire, les configurations de détecteurs MALS et RALS/LALS sont conçues pour gérer toute la gamme de masses moléculaires présentes dans votre échantillon. Cependant, si vous êtes principalement intéressé à analyser des matériaux petits et de faible masse moléculaire, alors un détecteur RALS pourra prendre en charge la majorité de vos analyses. Disposer d’un détecteur LALS complémentaire garantira que toutes les fractions importantes de votre échantillon, ou les potentiels agrégats, sont observés avec précision, même s’ils existent en faible concentration dans votre échantillon. Un détecteur MALS peut déterminer la masse moléculaire correcte, mais comme tous les détecteurs observeront la même intensité de lumière diffusée pour les échantillons diffusant de manière isotrope et de petite taille, obtenir le même résultat plusieurs fois pourrait potentiellement devenir redondant.

L’exemple ci-dessus est souvent le cas pour les scientifiques étudiant les protéines. En raison de la nature ordonnée de leurs structures, les protéines sont des molécules relativement denses, ce qui signifie que même les espèces de haute masse moléculaire sont relativement petites. Même les protéines de masse moléculaire aussi élevée que 700 kDa n’ont qu’un rayon de 10 à 12 nm. Le potentiel pour des masses moléculaires élevées mais des tailles moléculaires relativement petites signifie que les protéines sont généralement des diffuseurs isotropes et sont des échantillons idéaux pour un détecteur RALS/LALS. Dans ce cas, le détecteur RALS serait le principal détecteur utilisé pour les calculs, le détecteur LALS détectant les agrégats ou les composants plus grands dans l’échantillon. Puisque les protéines sont généralement des diffuseurs isotropes, il n’y a aucun avantage supplémentaire à avoir les nombreux détecteurs à divers angles inclus dans un détecteur MALS.

Pour illustrer ce point, les masses moléculaires de plusieurs protéines ont été mesurées à l’aide d’un détecteur RALS et d’un détecteur MALS. Les données résultantes sont présentées dans la figure ci-dessous, où il est clair que les mêmes masses moléculaires sont obtenues avec les deux détecteurs. Cela confirme qu’un détecteur RALS fournit les mêmes résultats qu’un détecteur MALS pour les échantillons montrant une diffusion isotrope.

Masses moléculaires des protéines calculées à l’aide des détecteurs RALS et MALS ; Masses moléculaires en kDa

Si vous vous intéressez non seulement à la masse moléculaire mais aussi à la taille moléculaire, alors un détecteur MALS offre la possibilité de calculer le rayon de giration (Rg) d’un échantillon. Cependant, il y a une réserve : cela n’est possible que pour les échantillons avec un rayon supérieur à 10-15 nm, car le Rg est calculé à partir de la pente générée par la dépendance angulaire dans le graphique Zimm partiel. Si l’échantillon est un diffuseur isotrope, alors il n’y a pas de pente et le Rg ne peut être déterminé. En passant, le rayon hydrodynamique (Rh) des échantillons allant jusqu’à quelques nm peut être déterminé en combinant les données de viscosité intrinsèque (IV) d’un détecteur de viscosimètre avec les données de masse moléculaire obtenues d’un détecteur de diffusion de la lumière.

En outre, il peut y avoir certains éléments pratiques à considérer spécifiquement pour votre application. Si vous intégrez plusieurs détecteurs, notamment pour des applications UPLC, par exemple, la plus petite cellule d’écoulement présente dans le détecteur RALS/LALS peut être bénéfique. Alternativement, si vous avez déjà souffert de la contamination d’une cellule de diffusion de la lumière, vous pourriez trouver qu’une orientation spécifique de la cellule (telle que la cellule d’écoulement verticale dans le SEC-MALS 20) offre une robustesse et une fiabilité supplémentaires.

Bien sûr, la préférence personnelle est toujours un facteur lors de la décision sur un détecteur de diffusion de la lumière. Peut-être avez-vous toujours utilisé un détecteur MALS et êtes plus à l’aise pour calculer des masses moléculaires en utilisant un modèle d’extrapolation spécifique. Ou peut-être préférez-vous la simplicité et la directivité de l’approche RALS/LALS pour calculer la masse moléculaire. Ou peut-être travaillez-vous avec un budget et souhaitez maximiser la valeur de votre instrument.

Je veux faire un bref commentaire sur ce dernier point, car c’est quelque chose à quoi tout le monde peut s’identifier. Le coût de ces unités de détecteurs évolue en fonction du nombre de détecteurs de diffusion de la lumière individuels présents. Dans la configuration RALS/LALS, il y a deux détecteurs ; dans le SEC-MALS 20, il y en a vingt. Les prix varient en conséquence. Il n’y a pas d’inconvénient pratique à avoir la gamme d’angles disponible dans un détecteur MALS, mais comme discuté ci-dessus concernant les diffuseurs isotropes, les angles supplémentaires ne fournissent pas toujours des informations supplémentaires.

Et même si ce n’est pas la route la plus économique, vous pouvez même avoir à la fois des détecteurs MALS et RALS/LALS sur le même système, collecter les données simultanément et décider ensuite lequel utiliser pour les calculs lors de l’analyse des données.

J’espère avoir fourni suffisamment d’informations dans cet article pour vous aider à déterminer si un détecteur MALS ou RALS/LALS (ou les deux !) est la meilleure option pour vous et votre application. Quel que soit celui que vous choisissez, nous vous avons couvert !

Articles précédents :

• La valeur ajoutée d’un achat OMNISEC de Malvern Panalytical
• Qu’est-ce qu’une valeur dn/dc et pourquoi est-elle importante pour le GPC/SEC ?
• Pourquoi le signal de mon viscosimètre a-t-il un pic négatif ?
• Pourquoi ai-je besoin d’une norme si je dispose d’un système GPC/SEC avec un détecteur de diffusion de la lumière ?

« `