삼중 검출 GPC/SEC를 사용한 다당류 분지화 측정

서론

다당류는 글리코시드 결합에 의해 결합된 단당류와 이당류로 구성된 생체 고분자입니다.  자연에서 생성되는 다당류는 흔히 식물에서 저장 에너지로 사용됩니다.  이러한 고분자는 크기가 매우 크게 성장할 수 있고 분자량도 증가합니다.  다양한 종류의 고분자 중에서 낮은 분자량을 가진 종은 선형인 반면 높은 분자량을 가진 종은 분자량이 증가할수록 그 수가 증가하는 분지를 가지고 있습니다.

삼중 검출 겔 투과/크기 배제 크로마토그래피(GPC/SEC) 분석은 일반적으로 분자량 분포를 측정하는 데 사용됩니다.  이는 또한 점도계 검출기를 사용하여 샘플 내의 분지화 정도를 측정하는 데에도 사용할 수 있습니다.  여기서는 분지화된 다당류로 확인된 2개의 샘플과 이에 대응하는 선형 다당류로 확인된 1개의 샘플에 대해 삼중 검출 크로마토그래피를 통해 분자량 분포(MWD) 및 분지화를 분석하였습니다.

실험

65°C로 4시간 동안 가열한 0.1M의 NaNO₃에 다당류 샘플을 용해시킨 다음 0.2μm 나일론 필터를 사용하여 여과하였습니다. 그런 다음 검출에는 Viscotek 삼중 검출 어레이(TDA) 시스템을 사용하고 용매와 샘플 전달에는 Viscotek GPCmax 펌프/오토샘플러 결합 시스템을 사용하여 2개의 분지화 샘플 및 선형 기준 샘플을 분석하였습니다.  컬럼은 ViscoGel GMPWXL 30cm x 7.8mm 컬럼을 사용하였습니다.  TDA 내 컬럼과 검출기 온도는 30°C로 일정하게 유지하였습니다.  샘플은 약 1mg/mL의 농도로 준비하였습니다.  가변 주입 용량 오토샘플러를 통해 주입된 모든 주입 용량은 100μL로 고정하였습니다.  전달 유량은 1mL/분으로 일정하게 유지하였습니다.  GPCmax 주입 순서 및 용매 전달 제어에는 OmniSEC 소프트웨어를 사용하였습니다.  고급 검출, 획득 및 계산에도 동일한 소프트웨어를 사용하였습니다.   특히 선형 기준 물질에서 샘플의 크기가 크기 때문에 분자량 측정에는 저각 광 산란(LALS)을 사용하였습니다.  LALS는 다른 광 산란 기법에서 필요한 가정이나 데이터 피팅없이 직접 분자량을 측정할 수 있기 때문에 다당류에 대해 선호되는 광 산란 기법입니다.  OmniSEC 소프트웨어는 분자가 충분히 작아지면 자동으로 RALS로 전환합니다.

결과

그림 1a는 선형 기준 샘플에 대한 삼중 크로마토그램입니다.  Y축은 각 검출기에 대해 정규화된 강도입니다.  주된 고분자 피크는 7mL에서 용리되고 이어서 11.5mL에서 용매 피크가 용리되며 이는 RI 신호에 대해 음의 피크로 나타납니다. 마지막으로 점도계로 측정되는 점도계 홀드업 피크는 약 15mL에서 용리됩니다.  2개의 광 산란 신호는 잘 중첩됩니다.  이들은 예상대로 동일한 용리 부피에서 피크가 나타납니다.  

그림 1에서는 a) 선형 다당류 및 b) 최초 분지화 다당류 및 c) 이차 분지화 다당류에 대해 RI, 저각 및 직각에서 광 산란으로 얻은 원시 데이터, 브릿지 점도계로 측정한 차압 등이 나와 있습니다.

검출기간 지연이 고려되긴 했지만 검출기와 RI 신호는 광 산란 신호 이후에 피크가 나타나며 이는 샘플의 다분산성을 보여줍니다.  이러한 신호는 또한 선형 고분자에서 흔히 볼 수 있는 가우스 유형 분포 곡선과 유사하다는 점에 주목해야 합니다.

그림 1b는 최초 분지화 샘플에 대한 고급 크로마토그램입니다.  여기서 피크는 더 작은 용리 부피에서 특히 광 산란 신호에 대해 추가로 검출된 물질을 보여줍니다.  그림 1c는 이차 분지화 샘플입니다.  여기서 피크는 주된 피크의 왼쪽에 훨씬 더 강한 신호가 있음을 보여줍니다.  2개의 분지화 샘플은 선형 기준 샘플에 비해 더 큰 용리 부피에서 피크가 나타납니다.

샘플에 대한 분지화 정도를 측정하기 위해서는 샘플의 선형 유사체가 필요합니다.  유사한 고분자로부터 고유 점도 대 분자량을 로그-로그 척도에 표시하여 Mark-Houwink(MH) 플롯을 생성합니다.  피팅의 기울기 및 절편은 각각 Mark-Houwink 및 로그[k] 값입니다.  특히 특성이 잘 알려진 고분자의 경우 문헌에 제시된 MH 매개 변수를 사용할 수도 있습니다.  이 경우에는 다당류의 선형 샘플이 직접 측정되었습니다. 

그림 2에서는 빨간색으로 표시된 선형 샘플의 MH 플롯을 보여줍니다.  Mark-Houwink 플롯에서 선형 기준 샘플의 분포가 2개의 분지화 샘플의 높은 분자량까지 확장되지 않음을 알 수 있습니다. 하지만 OmniSEC 소프트웨어에서는 데이터 외삽을 통해 분지화 샘플의 범위를 전부 포함합니다. 이를 통해 해당 샘플을 선형 기준과 비교할 수 있습니다.

 그림 3에서는 OmniSEC의 Branching View(분지화 보기)에 있는 분지화 샘플 "Bra1"에 대한 Mark-Houwink 플롯과 선형 샘플 "Lin1"의 중첩을 보여줍니다.  "Lin1" 플롯에는 외삽 도구(손잡이가 있는 검정색 선)와 계산 한계(회색 영역 사이)가 중첩됩니다. 사용자는 외삽 도구를 사용하여 선형 샘플에 대한 Mark-Houwink 플롯의 기울기를 더 크거나 작은 분자량으로 확장하여 선형 Mark-Houwink 플롯이 분지화 샘플의 전체 범위를 포함하도록 할 수 있습니다. 계산 한계는 계산이 수행되는 데이터 범위를 정의합니다. 이 경우 분포에서 매우 높은 MW 부분은 피크가 분지화 샘플 "Bra1"의 기준선에 도달함에 따라 데이터 품질이 저하되기 때문에 계산에서 제외됩니다.

그림 2 3개의 고분자 샘플에 대한 Mark-Houwink 플롯의 중첩

그림 3 더 큰 분자량에서 분지화 계산을 위한 선형 샘플의 외삽

분지화 개수 및 분지화 주기는 다분산, 무작위 분지화 고분자에 대한 Zimm-Stockmayer 식에 따라 계산됩니다.  이들 샘플에 나타나는 높은 분지화 정도는 각 용리 부피에서 샘플이 다분산임을 의미합니다.

식 1과 2에서 B_n는 분지화 샘플의 고유 점도를 선형 고분자의 고유 점도로 나눈 비율을 사용하여 계산되는 분지 개수입니다.

식 3에서 ε은 형상 계수(일반적으로 약 0.75)입니다.

분지화 주기(λ)는 B_n을 분자량과 고분자의 반복 단위로 정규화됩니다.
여기서 R은 반복 단위이고 M_w은 분자량입니다.

이 계산에서는 18,200달톤의 반복 단위를 사용하였습니다. 이 값은 100 포도당 단위와 같고 다당류에서 반복 단위에 대해 흔히 사용되는 값입니다.  3개의 고분자에 대한 결과는 표 1에 나와 있습니다.  분지화 샘플의 분자량이 선형 다당류 분자량의 약 2배이지만 그 크기는 선형 다당류 중 하나의 절반보다 작으며 이는 연쇄 분지화가 있을 때 고분자가 얼마나 조밀해지는지를 보여줍니다. 

표 1 다당류 샘플로부터의 결과

결론

이들 샘플은 100 포도당 단위에 기반한 분지화 주기를 근거로 높은 분지화 정도를 보여주었습니다. 64 및 56의 분지화 주기는 따라서 분지를 가지고 있는 포도당 단위의 64% 및 56%와 동일한 것으로 해석할 수 있습니다. 이러한 유형의 계산은 광 산란 및 점도 데이터를 사용하는 경우에만 가능합니다.  분지화 분자의 반경이 15nm 미만이고 분지화 계산을 위한 크기를 신뢰성있게 측정하기에 충분한 비등방성 광 산란을 보여주지도 않기 때문에 각도에 종속적인 광 산란만에 의한 크기 측정은 불가능합니다.