바이오제약 산업에서는 단백질 응집이 주요 문제로 인식되고 있습니다. 단백질은 시간의 경과에 따라 응집되는 경향이 있으며 생물학적 약물은 응집체의 존재가 면역 반응을 자극할 위험이 있습니다. 크기 배제 크로마토그래피(SEC)는 단백질 응집을 연구하는 데 일반적으로 사용하는 강력한 도구입니다.
SEC는 단백질을 크기로 분리합니다. 분자량을 측정하고 응집을 특성화하는 데 일반적으로 사용됩니다. 대부분의 SEC 시스템이 자외선(UV)과 같은 단일 농도 검출기를 사용하지만, 광 산란을 추가할 경우 보존 체적과 상관없이 단백질의 분자량을 측정할 수 있습니다. 그런 다음 시료 내에 존재하는 모노머, 올리고머 및 응집체의 분자량을 측정하여 거동을 이해할 수 있습니다 또한 다각도 광 산란(MALS)을 사용하여 빛을 비등방성(각도 측면에서 고르지 않게)으로 산란시키는 분자의 회전 반경(Rg)을 측정할 수 있습니다.
Viscotek SEC-MALS 20 시스템(그림 1)은 용리 용적과 상관없이 단백질 및 단백질 응집체의 분자량을 측정할 수 있는 20개의 측정각을 가진 광 산란 장비입니다. 농도 검출기(RI, UV), 고유 점도(IV), 동적 광 산란(DLS) 등의 검출기를 추가할 경우 단일 SEC 측정에서 이용 가능한 정보의 양이 크게 증가합니다. 이 응용 노트에서는 선택한 단백질을 SEC를 이용하여 분리합니다. SEC-MALS로 올리고머와 응집체의 분자량을 측정하고 결과에 대해 논의합니다.
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농도를 측정하기 위해 TDA RI 검출기와 연결한 후 SEC-MALS 20 시스템과 Viscotek TDAmax 시스템을 연결하였습니다. 시료는 2x Viscotek 단백질 컬럼을 사용하여 분리하였습니다. 이동상은 인산완충식염수였으며 모든 시료는 이동상에 용해시켰습니다. 분자량 특성이 잘 알려진 단백질인 소혈청알부민을 사용하여 SEC-MALS 시스템을 보정했습니다. 분리를 원활히 진행하고 검출기의 기준선 안정성을 극대화할 수 있도록 검출기와 컬럼을 모두 30°C에서 보관했습니다.
BSA 시료는 일반적으로 모노머, 올리고머, 큰 응집체가 결합되어 있습니다. 여기서, 모노머, 다이머, 트라이머 피크는 분명히 볼 수 있으며 해당 분자량은 MALS로 정확하게 측정했습니다. 시료에는 개별적으로 분석되지 않는 다분산 상태의 응집체도 일부 포함되어 있습니다. 그림 2에 BSA 크로마토그램이 나와 있으며 BSA 측정의 결과는 표 1에 나와 있습니다.
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| 응집체 | 트라이머 | 다이머 | 모노머 | |
|---|---|---|---|---|
| Peak RV - (ml) | 13.84 | 14.31 | 15.37 | 17.05 |
| Mn - (kDa) | 337.3 | 199.4 | 133.6 | 66.1 |
| Mw - (kDa) | 378.3 | 201.2 | 133.9 | 66.3 |
| Mw/Mn | 1.122 | 1.009 | 1.003 | 1.002 |
| Rg(w) - (nm) | N/C | N/C | N/C | N/C |
| Wt Fr (Peak) | 0.04 | 0.057 | 0.423 | 0.745 |
모노머, 다이머, 트라이머 피크의 분자량이 매우 안정적임을 분명히 확인할 수 있습니다. 이러한 특성은 단백질이 개별적으로 분자량이 매우 밀접하게 제어되고 단분산으로 간주되는 경우 일반적입니다. 이러한 분자량은 안정적이어서 올리고머임을 나타내지만, 다분산 개체군으로 구성된 초기의 용리 물질에서는 분자량 추적이 더욱 가변적입니다. 이러한 특성은 변성되어 더 이상 기능하지 않을 가능성이 높은 응집체에서 일반적으로 나타납니다. 각 피크에서 전체 시료 중 비율은 'Wt Fr' 행에 식별되어 있습니다.
두 번째 조사한 단백질은 사이로글로불린이며 해당 크로마토그램은 그림 2에 있습니다. 다른 각도의 MALS 신호는 그림 3의 MALS 도표에 나와 있으며 계산 결과는 표 2에 있습니다.
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| 응집체 | 모노머 | |
|---|---|---|
| Peak RV - (ml) | 11.60 | 12.50 |
| Mn - (kDa) | 1601.0 | 681.5 |
| Mw - (kDa) | 2588.0 | 686.0 |
| Mw/Mn | 1.617 | 1.007 |
| Rg(w) - (nm) | N/C | N/C |
| Wt Fr (Peak) | 0.167 | 0.833 |
사이로글로불린 시료는 RI 검출기를 따를 경우 2개 피크로 분리되지만 SEC-MALS 검출기를 따를 경우 3개로 분리됩니다. SEC-MALS 검출기는 RI 검출기에만 표시되는 매우 큰 응집체 중 극소량을 식별합니다.
모노머의 분자량은 686kDa로 측정되었습니다. 이 수치는 사이로글로불린 분자량 669kDa의 3% 이내입니다. 피크 전체적으로 안정적이어서 이 개체군이 단분산임을 나타냅니다. 단일 성분으로 분석된 응집체 피크는 더 높고 가변적인 (다분산) 분자량을 나타내며 무질서한 응집체임을 분명히 알 수 있습니다. 이 피크의 단백질이 활동성이 있을 가능성은 거의 없으며 제약 시료였을 경우 이러한 응집체는 면역반응을 일으킬 가능성이 높습니다. 응집체는 시료의 약 17%를 차지하고 있습니다. 이 단백질의 분자량이 높음에도 불구하고 SEC-MALS 디스플레이에서 모노머와 응집체의 분산이 등방성임을 분명히 알 수 있습니다. 그러므로 이 시료에서는 모든 피크의 Rg를 측정할 수 없습니다.
마지막으로 측정한 시료는 펩신이었으며 해당 크로마토그램은 그림 4에 나와 있습니다. 다른 각도의 SEC-MALS 신호는 그림 5의 MALS 도표에 나와 있으며 계산 결과는 표 3에 있습니다.
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| 응집체 | 모노머 | 분해 제품 | |
|---|---|---|---|
| Peak RV - (ml) | 10.84 | 18.33 | 20.92 |
| Mn - (kDa) | 3892.0 | 34.4 | 4.7 |
| Mw - (kDa) | 4431.0 | 34.7 | 6.4 |
| Mw/Mn | 1.138 | 1.008 | 1.364 |
| Rg(w) - (nm) | 69.9 | N/C | N/C |
| Wt Fr (Peak) | 0.008 | 0.569 | 0.423 |
펩신 시료를 2개의 주요 피크로 분리했습니다. 두 번째 피크의 분자량은 34.7kDa로 측정되었으며, 이 수치는 펩신의 알려진 분자량인 35kDa에 매우 가깝습니다. 더 큰 피크에는 더 높고 가변적인 분자량이 있어 활동성이 거의 없는 무질서한 응집체임을 분명히 알 수 있습니다. 이와 같이 큰 광 산란 피크임에도 불구하고, 응집체는 시료의 전체 물질 중 1% 미만을 차지합니다. 이 경우 MALS 도표에서 이러한 응집체가 비등방성 산란체임을 확실히 알 수 있습니다. 즉, 해당 Rg를 실제로 측정할 수 있으며, 해당 수치는 표에 거의 70nm로 표시되어 있습니다. 펩신은 비원형 구조이므로 동일한 분자량의 단백질의 경우보다 일반적으로 크기가 크다는 것을 의미합니다. 응집체의 크기는 응집체에서 구조가 실제로 지속되며, 그런 다음 매우 커지는 것을 나타냅니다. 이 경우는 펩신 응집체 분자량의 절반을 초과하는데도 크기가 훨씬 작은(<15nm) 사이로글로불린 응집체와 비교됩니다. 펩신 모노머는 너무 작아 Rg 측정을 수행할 수 없습니다.
시료에 확실히 정의되지 않은 세 번째 피크가 있지만 약 6kDa로 분자량을 갖는 것을 알 수 있습니다. 이 펩신 시료는 소화 효소로 자신을 소화시키고 있을 가능성이 높고, 일부 소화되고 있음을 결과를 통해 알 수 있습니다.
이 응용 노트는 Viscotek SEC-MALS 20 시스템을 사용하여 다양한 단백질의 분자량 및 응집체를 성공적으로 측정하는 방법을 보여 주었습니다. 이 장비는 단백질의 용리 용적 또는 구조와 상관없이 단백질 분자량을 측정할 수 있습니다. BSA 올리고머, 사이로글로불린, 펩신 응집체의 분자량을 성공적으로 측정하고 해당 양을 수량화했습니다. 응집체의 크기가 충분이 클 경우 해당 크기(Rg)도 측정할 수 있습니다.
