단백질과 상호 작용하는 리간드를 식별하기 위한 화합물 라이브러리의 생물리학적 선별은 효율적이지만 리간드가 기능적 특성을 간섭하는지 여부 또는 어떻게 간섭하는지에 대해서는 알 수 없습니다. 이를 위해서는 생화학적/기능적 분석이 필요합니다. 그러나 구조적 변화에 따라 기능이 달라지는 단백질의 경우 이러한 분석은 일반적으로 복잡하거나 처리량이 낮습니다.
본 연구에서는 단백질과 결합 시 실시간으로 구조적 변화를 유도하고 동적 영역을 식별하는 단편을 검출하기 위해 고 처리량의 2차 고조파 생성(SHG) 바이오 센서\에 대해 살펴보았습니다. 멀티웰 플레이트 형식 SHG 분석은 리간드 게이트 이온 채널(LGIC)의 동족체인 아세틸 콜린 결합 단백질(AChBP)의 야생형 및 6개의 설계된 단일 시스테인 돌연변이를 위해 개발되었습니다. 아민 또는 말레이미드 결합을 통해 두 번째 고조파 활성 수준과 결합되었습니다.
단백질과 상호 작용하는 리간드를 식별하기 위한 화합물 라이브러리의 생물리학적 선별은 효율적이지만 리간드가 기능적 특성을 간섭하는지 여부 또는 어떻게 간섭하는지에 대해서는 알 수 없습니다. 이를 위해서는 생화학적/기능적 분석이 필요합니다. 그러나 구조적 변화에 따라 기능이 달라지는 단백질의 경우 이러한 분석은 일반적으로 복잡하거나 처리량이 낮습니다.
본 연구에서는 단백질과 결합 시 실시간으로 구조적 변화를 유도하고 동적 영역을 식별하는 단편을 검출하기 위해 고 처리량의 2차 고조파 생성(SHG) 바이오 센서\에 대해 살펴보았습니다. 멀티웰 플레이트 형식 SHG 분석은 리간드 게이트 이온 채널(LGIC)의 동족체인 아세틸 콜린 결합 단백질(AChBP)의 야생형 및 6개의 설계된 단일 시스테인 돌연변이를 위해 개발되었습니다. 아민 또는 말레이미드 결합을 통해 두 번째 고조파 활성 수준과 결합되었습니다.
이 분석법을 검증하기 위해 니코틴 아세틸 콜린 수용체(nAChR) 작용제와 길항제에 의해 AChBP에서 유도되는 구조적 변화가 질적으로 다르다는 사실을 확인했습니다. 이후 1,056개 단편 라이브러리가 모든 변이체에 대해 선별되었고 AChBP의 구조적 조절인자가 AChBP 변이체에 따라 적중률 9~22%로 성공적으로 식별되었습니다. 직교 검증 및 구조 해석을 위해 4개 적중의 하위 집합이 선택되었습니다. 시간 분해 도파관 간섭법 기반 바이오 센서 분석은 상호작용이 가역적인 1단계 1:1 상호작용임을 확인했고, 친화성 및 상호 작용 동역학 속도 상수 추정치(KD = 0.28–63 μM, ka = 0.1–6 μM−1 s−1, kd = 1 s−1)를 제공했습니다. 두 개의 단편에 대한 X선 결정학을 통해 LGIC의 조절 부위에 해당하는 이전에 설명한 구조적 동적 부위에서 이들의 결합을 확인했습니다.
이러한 결과는 SHG에 단백질의 구조적 변화를 유도하는 단편을 식별하는 감도가 있음을 보여줍니다. 알려진 LGIC 조절인자와는 다른 반응 프로파일을 가진 일련의 단편 적중 결과가 특성 분석되고 단백질의 동적 영역에 결합하는 것으로 확인되었습니다.
