응집 온도(Tagg) – 그것이 무엇이며, 어떻게 계산할 수 있을까요?
Zetasizer를 사용하여 응집 온도 측정하기
동적 광 산란(DLS)에서는 용액 내 입자의 유체역학적 크기와 크기 분포를 얻을 수 있습니다. 이 측정을 시간과 온도의 함수로, 또는 Malvern Zetasizer 소프트웨어에서 ‘트렌드’라고 부르는 것처럼 확인해 보는 것도 흥미로울 수 있습니다. 생물학적 단백질 샘플의 경우, 이 온도 트렌드는 특히 흥미롭습니다. 낮은 온도에서는 단백질이 안정적이며 반복 가능한 크기(및 산란 강도) 측정을 보일 수 있지만, 일반적으로 높은 온도(Tagg)에서는 단백질 분자가 올리고머화되거나 응집하는 경향을 보일 것입니다. 이러한 현상이 일어나는 온도는 단백질 자체 및 완충제 조성에 따라 달라지며, 일반적으로 측정 시작 시 단백질이 균일할 때만 명확히 관찰됩니다.
재조합 인간 알부민의 안정성을 논의한 예시는 “광 산란을 사용하여 Recombumin의 열적 안정성을 연구하기 – 유통 기한 예측“라는 응용 노트에서 설명되었습니다.
어떻게 Tagg를 결정할 수 있을까요?
전통적인 방법으로 응집 온도 Tagg를 결정하는 것은 정규화된 강도를 온도와 비교하는 것입니다. 응집 지점은 기울기가 10 이상인 최초의 지점으로, 기울기는 이전 5개의 데이터 포인트를 포함합니다. 이 방법은 z-평균 크기나 다분산 지수를 통해 수정될 수 있습니다. 현재 소프트웨어는 두 가지 적합 알고리즘을 포함합니다:
- 단일 매개변수(카운트 속도만) 분석
- 다중 매개변수(크기와 카운트 속도) 분석
다중 매개변수 적합은 유체역학적(z-평균) 크기와 파생(파생된) 산란 카운트 속도 모두의 변화를 고려하며 선호되는 방법입니다. 현재 소프트웨어에서 두 분석 방법의 전형적인 차이를 보여주는 스크린샷이 제공됩니다.
Example Results.dts 파일에서 제공된 헤모글로빈 응집 온도 점의 예시로, 오래된 단일 매개변수 방법은 38ºC의 결과를, 새로운 다중 매개변수 방법은 42ºC의 결과를 제공했습니다. 절대적인 변화는 너무 큰 문제는 아니며, 메서드를 일관되게 사용하면서 서로 다른 데이터 세트를 비교할 때 중요합니다. 이 메뉴를 보려면 데이터 세트를 강조 표시하고, 마우스 오른쪽 버튼을 클릭한 후 결과 수정을 선택하세요.
왜 Tagg가 Tmelt와 다른가요?
응집 온도는 응집이 시작되는 시점을 감지합니다. 분자들이 함께 응집되는 경향이 있는 온도를 감지하는 것입니다. 녹는 온도인 Tmelt 혹은 Tm는 (거의) 완전한 단백질 변성의 결과입니다. 이는 미세 열량 측정(DSC)이나 원형 이색성(CD)을 통해 확인할 수 있으며, 각각 열용량의 작은 변화와 전체 구조를 감지할 수 있습니다. 작은 분자 크기 변화와 올리고머화 시작에 대한 극도의 민감성 때문에 응집 온도(Tagg)는 일반적으로 녹는 온도(Tmelt)보다 낮게 관찰됩니다.
어떻게 Tagg를 위한 측정을 설정할 수 있을까요?
Zetasizer는 자동 트렌드 측정을 온도에 대한 것으로 허용합니다. 메뉴에 접근하려면 수동 측정을 시작하거나 SOP를 생성하세요. 그런 다음 창의 왼쪽 상단에서 측정 유형 – 트렌드 – 온도 – 크기를 선택하여 기본 설정으로 시작합니다. 특히 트렌드 시퀀스의 메뉴 항목을 검토하고 시작 및 종료 
온도와 온도 간격을 입력하세요. “응집점 확인” 옆에 체크 표시를 해주세요. “크기 측정” 설정에서는 각 단계에서의 평형 시간을 제공하세요. 나는 “상관 데이터만 포함하여 저장할 결과 허용” 옆에 체크 표시를 하기를 권장합니다. 이렇게 하면 샘플이 매우 응집된 경우(즉, 응집 온도를 초과한 경우)라도 데이터를 저장할 수 있어 유용할 수 있습니다.
SOP는 실험 길이를 예상하고 이는 트렌드와 크기 측정 섹션에 표시됩니다(계산을 업데이트하기 위해 다른 것을 클릭해야 할 수도 있습니다). SOP 또는 수동 측정은 일반 측정처럼 시작할 수 있습니다.
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