DSC와 단백질 안정성: 엔탈피 변화는 무엇을 의미하나요?
차분 주사 열량 분석법 (DSC)은 단백질, 핵산 또는 기타 생체 고분자의 열 변성과 같은 열 전이의 엔탈피 변화 (∆H)를 직접 측정하는 유일한 분석 방법입니다.
∆H란 무엇인가요?
∆H는 일정한 압력 하에서 시스템을 온도 T로 상승시키는 데 소요되는 총 에너지를 의미합니다. 단백질의 경우, 이는 단백질을 펼치는 데 소비되는 에너지(열)를 의미하며, ∆H는 양의 값을 가지며 흡열 과정을 나타냅니다. 이 에너지는 모든 원자 및 분자 운동과 더불어 단백질을 접힌 구조로 유지하는 결합 에너지와 관련이 있습니다.
∆H는 열량 곡선 아래의 면적을 적분하여 계산되며, 단백질 몰당 칼로리(또는 줄)로 표현됩니다. DSC 실험 중 단백질이 증가하는 온도에 노출되면서 비공유 결합이 깨지면서 단백질이 열 변성을 시작합니다. ∆H는 단백질을 원래의 접힌 상태로 유지하기 위해 필요한 결합의 수와 관련이 있습니다.
∆H는 총 단백질 농도를 얼마나 정확하게 측정하느냐에 따라 달라집니다. 단백질 농도가 정확하게 측정되지 않으면 계산된 ∆H 값에 영향을 미칩니다.
실제로 ∆H 값은 우리에게 무엇을 알려줄까요?
다른 단백질의 DSC 결과를 비교할 때, ∆H 값이 더 큰 단백질이 항상 작다거나 단백질보다 더 안정적인 것은 아닙니다. ∆H는 총 몰 농도당 정규화되므로, 그 값은 종종 단백질의 크기에 비례할 수 있습니다. 대부분의 단백질은 같은 결합 밀도(부피당 결합)를 가지고 있습니다. 분자량이 큰 단백질이라면 ∆H도 더 클 것으로 예상할 수 있습니다.
∆H는 용액 내의 원래 단백질 비율에 따라 달라집니다
중요한 고려 사항은 DSC가 초기 접힌(원래) 형태의 단백질에 대해서만 ∆H 값을 측정한다는 점입니다. ∆H의 크기는 접힌 부분의 농도에 따라 달라집니다. 초기 접힌 단백질 부분이 총 단백질 농도의 100% 미만인 경우, 계산된 ∆H 값은 이에 따라 작아질 것입니다.
아래 그림은 저장 중에 다른 시간에 측정한 같은 단백질의 DSC 열량 곡선을 보여줍니다. 파란색 열량 곡선은 새로 준비된 100% 원래 단백질(접힌 단백질) 샘플에 대한 것입니다. 저장 중 단백질 샘플이 악화되기 시작하면, 용액 내의 원래 단백질 비율이 감소하게 되어 DSC 열량 곡선에서 엔탈피가 감소합니다. 100% 원래 단백질 레퍼런스 DSC 열량 곡선이 있을 때, 다른 열량 곡선의 상대적인 ∆H 값을 사용하여 각 샘플의 접힌 단백질 비율을 추정할 수 있습니다.
이 예에서, 녹색 열량 곡선의 샘플의 ∆H는 파란색 샘플의 50%이므로 50%의 접힌 단백질입니다. 주황색 샘플은 25%의 접힌 단백질, 빨간색 샘플은 파란색 열량 곡선에 비해 10%의 접힌 단백질입니다.
열량계적 엔탈피와 반트호프 엔탈피
이 블로그에서는 DSC로 직접 측정된 “열량계적” 엔탈피, 흔히 ∆Hcal로 표현되는 엔탈피에 대해 설명했습니다. DSC 데이터에서 계산할 수 있는 또 다른 유형의 엔탈피인 반트호프 엔탈피 – ∆HvH가 있습니다. 이 값은 DSC 비이상 모델 적합성에서 사용 가능합니다. ∆HvH는 원형 이색성과 같은 비열량적(간접적) 열 용융 기술에서 결정된 엔탈피이기도 합니다.
DSC를 사용할 경우, ∆Hcal는 전이 피크 아래의 면적에 의해 결정되며, ∆HvH는 전이 피크의 모양에 의해 결정됩니다. 전이가 더 날카로울수록 ∆HvH가 더 크고, 그 반대도 마찬가지입니다. ∆Hcal는 농도에 따라 달라지지만, HvH는 그렇지 않습니다.
일반적으로, ∆Hcal /∆HvH 비가 1인 경우, 연구 중인 전이가 이질 상태 펼침 메커니즘을 따르고 있음을 나타냅니다. ∆Hcal /∆HvH 비가 1보다 큰 경우, 상당히 많이 발견되는 중간체의 존재를 나타내며, ∆Hcal /∆HvH 비가 1보다 작은 경우, 분자 간 상호작용을 나타냅니다.
∆Hcal /∆HvH를 사용하여 단백질의 큰 부분이 비활성 상태임을 추정할 수 있습니다. 우리가 간단한 단일 도메인 단백질을 가지고 있고, 중간체가 없다고 가정하면, 그 펼침이 ∆Hcal /∆HvH 비가 1에 가깝다고 예상할 수 있습니다. 그래서 ∆Hcal이 ∆HvH 보다 상당히 낮으면, 이는 단백질의 큰 부분이 이미 비활성 상태임을 나타낼 수 있습니다.
요약하자면, ∆H 데이터의 DSC 분석은 단백질의 펼침 메커니즘과 원래의 형태로 존재하는 단백질량에 대한 통찰을 제공할 수 있습니다.
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