LALS 왜 가까울수록 좋은가? – Viscotek GPC system

 

서론 

 


  현재 GPC/SEC(겔 투과크로마토 그래피/크기 배제 크로마토그래피) 실험에서 분자량을 측정할 때 레이저 광산란 검출기가 많이 이용되고 있습니다.  

 

  분자량이 LS(광산란) 검출기 신호에서 직접 측정된다는 장점으로 인해 고분자 또는 표준단백질을 사용하여 용리 용적을 보정할 필요가 없어 많은 사용자들이 선호하고 있습니다. 또한 LS 검출기로 측정된 분자량은 중합체 유형과 구조와는 별개입니다.  

 

  이러한 이유로 GPC-LS 로 측정된 분자량을 절대 분자량이라고 합니다. 실제로 모든 GPC-LS 검출기에는 보정 작업이 필수적인데, 현재 사용 중인 LS 검출기 중 대부분이 데이터 외삽 또는 데이터 보정을 통해 분자량을 구하고 있어 절대치라고 하기에는 상당한 괴리가 있습니다. 

 


  본 응용 노트에서는 이 문제와 관련한 이론을 설명하고, LALS(저각 광산란)가 분자량에 정비례하는 산란광의 각도를 실제로 측정하는 유일한 LS 기술인지에 대해서 설명합니다. 

 

 

광산란 이론 

 


  먼저, 측정된 용량(산란광의 강도)과 원하는 결과(무게평균 분자량) 간의 상관관계를 들여다볼 필요가 있습니다. 이 두 인자는 잘 알려진 Releigh 방정식으로 연결되어 있습니다.  

 

 

 

  이때, R=o 는 o 도에서의 산란강도를, Mw 는 평균분자량, c 는 용액의 농도, K 는 광학상수 값으로 dn/dc 를 의미하며 A2 는 제 2 비리얼 계수를 의미합니다. 

 


  낮은 농도의 용액인 경우(e.q. 일반적인 GPC 조건), 농도가 매우 낮기 때문에 이 영향을 무시 할 수 있습디다. 이로 인하여 수식은 아래와 같이 간단해집니다. 

 

 


  간단해진 수식을 이용하여 산란광의 값으로부터 직접 Mw 를 구할 수 있습니다.  그러나 이 방정식은 0 도(예: 0°)에서 산란광에 관한 식이라는 점을 이해할 필요가 있습니다.  

 

  물론, 입사 레이저 빔으로 인해 0°에서 산란광을 측정하는 것은 불가능하므로, 몇 가지 다른 각도에서 산란광을 측정해야 합니다(그림 1). 그러나 이로 인해 산란광 양이 산란각과 측정되는 분자 크기에 따라 크게 달라지기 때문에 공정이 복잡해집니다.  

 

 

  분자 크기가 매우 작은 경우에만 이러한 각 의존성 효과를 무시할 수 있습니다. 분자 크기가 12nm 보다 큰 경우에는 용액에 문제가 발생합니다. (1) 

 


이 이론에 따르면 기본적으로 세 가지 해결 방법이 있습니다. 

 


1. Multi-angle Light
Scattering(MALS). 두 가지 이상의 각도에서 산란광을 측정하고 0 도에 데이터를 외삽합니다. 

 


2. 90 도 광산란/점도(RALS/점도).
산란광을 90°에서 측정하고 점도 데이터를 사용하여 0° 값을 보정합니다. 

 


3. Low Angle Light
Scattering(LALS). 각 효과가 무시할 수 있는 수준이 되도록 0°에 가까운 Low angle 에서 측정합니다. 이 경우 보정이 필요 없습니다.  

 

  MALS 와 RALS/Viscosity 를 사용하는 수백 종의 장비가 현재 전 세계에 널리 사용되고 있으나, 이 중 어떤 제품도 분자량을 직접 측정하지는 않습니다. 

 


  이 Multi-anlge 접근법은 항상 데이터 외삽에 의존하며 RALS 접근법은 점도계를 사용하여 크기가 큰 분자에 대한 데이터 보정이 필요합니다. 

 


  역사적으로 보면 최초의 보정 이후 분자량을 직접 측정하므로, Multianlge 방식처럼 추정 및 데이터 조작이 필요 없다는 이유로 LALS 접근법이 유일한 절대 방식으로 여겨져 왔습니다.  

 

  상업용 LALS 검출기는 1970 년대 후반에서 1980 년대 후반까지 생산되었던 Chromatix KMX-6 를 벤치마킹하였습니다.  그러나 1990 년대에는 LALS 검출기가 전혀 생산되지 않았습니다.  

 

  2001 년이 되어서야 새로운 Viscotek 의 LALS 검출기가 출시되어 GPC-LS 사용자가 직접 절대분자량을 측정할 수 있는 기회가 다시 열렸습니다. 

  

 

 

Multi-angle 접근법에 문제가 있는 이유 

 


  Multi-angle 장비는 두 가지 이상의 각도에서 산란광을 측정한 다음 측정 값을 0 도에 외삽하는 원리가 적용됩니다. 그러나 상당수의 사용자는 측정되는 값이 절대 분자량이라고 생각하는 경우가 많습니다.  

 

  그러나 모든 MALS 장비에는 보정 절차가 필수적이므로 이것은 사실이 아닙니다. 또한 분자량은 직접 측정이 아닌 데이터 외삽의 결과로 도출됩니다. 

 


  이것이 바로 MALS 방식의 가장 큰 약점입니다. 외삽에는 다양한 유형의 데이터 플롯 또는 외삽 피트가 존재하는데 각 샘플별로 어떤 것을 적용해야할까요? Debye? Zimm? Berry? 저분자의 경우, 선형 데이터 피트를 사용하는 것이 가장 정확한 값을 구할 수 있고, 분자의 크기가 커질수록 필요한 데이터 피트가 크게 달라집니다(2).  

 

  45nm 보다 큰 분자의 경우, 데이터 플롯은 곡선의 형태를 띠게 되고 선택한 데이터 피트에 따라 외삽된 분자량이 달라집니다. 즉, 작은 분자와 큰 분자가 모두 존재해 범위가 넓은 샘플의 경우 선택한 피트의 순서에 항상 영향을 받게 됩니다. 

 


  이와 연결된 Multi-angle 접근법의 또 다른 문제는 중요한 Low angle 영역 내 데이터의 부재입니다. Multiangle 검출기는 다양한 각도에서 데이터를 수집하도록 설계되어 실제 Low angle 에서 정확한 데이터를 수집할 수 없기 때문입니다.  

 

  그 결과 정확한 분자량을 얻는 것이 더욱 힘들어집니다. 외삽의 정확성(피트의 적합성)은 최저각 데이터 점이 0 에 얼마나 가까운지와 해당 신호의 품질에 따라 결정됩니다. (3) 

  

 

 

Low Angle Light Scattering(LALS) 

 


  진보된 LALS 접근법은 산란광을 0 도에 최대한 가깝게 측정하여(이 경우는 7°) 모든 외삽과 데이터 피팅 문제를 방지합니다.  

 

 

   

  그림 2 는 검출기의 광학 경로에 대한 내부를 보여주는 모형도입니다. 이러한 효율적인 설계는 산란광에서 입사빔을 효과적으로 구분합니다(4). 그 결과 7° 에서 탁월한 잡음 대비 신호를 수집 할 수 있습니다. 

 

 


  그림 3 은 90°(RALS) 및 7°(LALS)의 저분자량 폴리머와 고분자량 폴리머에 대한 신호대 잡음을 비교한 것입니다. 

 


  그림 3a 를 보면 분자량이 낮은 PEO 시료에 대하여 두 검출기 모두, 산란각에 상관없이, 동일한 결과를 얻을 수 있습니다. 이 크로마토그램은 90°도 신호(RALS)와 LALS 의 신호대잡음을 직접 비교한 결과, LALS 가 뛰어난 신호대잡음을 제공하는 것으로 나타났습니다. 

 


  LALS 직접 측정의 중요성은 다당류같은 크기가 큰 분자를 분석할 때 가장 두드러집니다. 이러한 유형의 분자는 산란광에 대한 각의존성이 매우 높아(그림 3b) RALS 와 특히 Multiangle 방식의 경우 심각한 문제가 발생됩니다.  

 

 

  7°에서 산란광을 직접 측정하면 외삽 또는 데이터 피팅이 필요 없고 정확한 분자량을 산출할 수 있습니다. 그림 4 는 LALS 방법을 사용하여 히알루산 샘플을 이용해 측정된 결과입니다(5).
 

 

 

결론 

 


  최첨단 LALS 검출기의 등장으로 GPC/SEC 연구실에서 샘플의 분자량을 정확하게 측정할 수 있게 되었습니다.  

 

  LALS 를 사용하면 데이터 외삽 또는 데이터 피팅과 관련된 문제를 예방할 수 있습니다. 또한 새롭게 출시된 LALS 제품은 크기가 작고 조작이 간단해 점도계가 포함된 통합 다중 검출기 시스템(6)에도 쉽게 사용할 수 있어 분자량과 분자 구조를 동시에 결정할 수 있습니다. (7, 8)  

 

  이것은 각도가 다양할수록 좋다는 기존의 인식을 뒤엎습니다. 실제로 산란광을 측정할 때에는 가까울수록 좋습니다&