Rh 또는 Rg: 어떤 것이 내 GPC/SEC 샘플에 가장 적합할까?

GPC/SEC(젤 침투 크로마토그래피/크기 배제 크로마토그래피)를 사용할 때의 주요 목표는 대개 고분자 샘플의 분자량을 결정하는 것입니다. Malvern Panalytical의 OMNISEC와 TDAmax 시스템과 같은 다중 검출기 시스템은 다른 분자 특성화 매개변수, 예를 들어 분자 크기 등의 매개변수도 제공합니다. 단백질이나 분자량이 이미 알려진 다른 샘플의 경우 분석의 유일한 목적은 샘플의 분자 크기를 결정하는 것입니다. 이러한 경우, 분자 크기는 종종 샘플의 궁극적인 기능이나 용도와 밀접하게 관련된 샘플의 분자 구조에 대한 중요한 정보를 제공합니다.

GPC/SEC 분석을 통해 사용할 수 있는 일반적인 분자 크기 측정 두 가지는 유체역학적 반경(Rh)과 회전 반경(Rg)입니다. 이전 글에서는 동적 광산란(DLS) 및 소각 X-선 산란(SAXS)을 사용하여 단백질 특성화에 Rh와 Rg가 어떻게 사용되는지 설명합니다. 이 글에서는 Rh와 Rg의 정의, GPC/SEC 컨텍스트에서 이 둘이 어떻게 계산되는지, 그리고 이들 차이의 실천적 영향에 대해 논의할 것입니다. 여기서 보다 자세한 정보(및 더 많은 수식!)를 원하시는 경우 연결된 문서들을 참조하세요.

Rh와 Rg의 정의

수학적 설명에 깊이 들어가지 않고(아직), 샘플의 Rh는 그 샘플의 분자량과 고유 점도로 계산된 동일한 질량과 밀도를 갖는 가상 구의 반경입니다. Rg는 분자의 중심에서부터 분자 구성 요소들의 제곱 평균 거리(root mean square distance)를 나타냅니다. GPC/SEC 분석에서 생성되는 단일 Rh와 Rg 값은 각각의 데이터 조각에서 계산된 값을 합쳐서 얻은 중량 평균 값입니다. 중량 평균 분자량(Mw)과 유사하게 이러한 값은 샘플을 전체적으로 특성화하는 데 가장 적합합니다. GPC/SEC 장비에서 분리된 상태로 배치 모드에서 실행되는 다각 광산란(MALS) 검출기는 z-평균 Rg 값인 Rgz를 제공합니다.

Rh와 Rg의 계산 방법

이제 수학에 대해 조금 설명하겠습니다. 아인슈타인의 구 입자 용액 점도 모델을 바탕으로 Rh, 분자량(M), 고유 점도([η]) 간의 관계는 아래와 같이 표시됩니다(N_A는 아보가드로 수입니다).GPC/SEC는 각 데이터 조각에서 분자량과 고유 점도를 직접 계산하기 때문에 이 공식으로 쉽게 Rh를 산출할 수 있습니다. 따라서 Rh 계산의 하한값은 굴절률(RI), 광산란, 점도계 채널에서 충분한 검출기 응답이 있는 가장 작은 샘플 부분에 맞춰집니다.

GPC/SEC에서 Rg를 계산하는 두 가지 옵션이 있습니다. 직접적이고 가장 일반적인 방법은 관찰 각도에 대한 산란광 강도의 변화를 관찰하는 것입니다. 이를 위해 최소 두 개의 각도로 샘플의 각도에 대한 의존성을 관찰할 수 있는 광산란 검출기가 필요합니다.

이전 글에서 Rh와 Rg에 대한 논의 그리고 광산란 검출기에 대한 최근 글에서 언급했듯이 단백질은 보통 10-15 nm보다 작기 때문에 GPC/SEC에서 단백질의 Rg를 결정하는 것은 어렵습니다. 즉, 모든 방향으로 균일하게 빛을 산란하는 등방성 산란체입니다. 저분자량 폴리머도 등방성 산란체이며, 그 결과 부분 Zimm 플롯은 0 기울기를 가지는 평행선이 되어, 이러한 작은 물질들의 경우 Rg가 결정될 수 없습니다. 이것은 그림 1의 왼쪽에서 묘사되었습니다.

Rg를 광산란으로 계산하려면 분자가 각도 의존성을 보여야 하며 이는 관찰 각도에 따른 산란광의 강도가 변한다는 것을 의미합니다. 이는 그림 1의 오른쪽에 예시된 경사진 부분 Zimm 플롯으로 나타납니다. 광산란 검출기에 사용되는 빛의 파장은 샘플이 각도 의존성을 보이는 크기 임계치에 영향을 미치므로, 광원 파장을 조정해 크기가 작은 범위로 Rg를 계산할 수 있습니다.

Rg를 계산하는 또 다른 방법은 분자량(M)와 고유 점도([η])를 Rg와 연관 짓는 아래의 플로리-폭스 방정식을 사용하는 것입니다(Φ₀는 상수로 간주됨).이 방식의 이점은 Rh처럼 Rg를 계산하는 하한값이 샘플이 각도 의존성을 보이는지 여부 대신 검출기 응답에 의존한다는 점입니다. 단점은 Φ₀가 실제로 연구 중인 샘플, 용매 및 결과 분자 구조에 따라 달라진다는 점입니다(무작위 코일에 가장 적합함). 따라서 이를 상수로 설정하면 어느 정도의 근사값이 도입됩니다. 일반적으로(그리고 이 글의 나머지 부분에서) Rg는 광산란 검출기에서 계산됩니다.

Rh와 Rg 데이터의 차이

주어진 분석을 위한 Rh와 Rg 데이터는 조사 중인 특정 샘플에 의존합니다. Rg 계산은 분자가 각도 의존성을 나타내야 하므로 만약 샘플이 각도 의존성을 드러내지 않는 등방성 산란체라면 Rg는 결정되지 않을 수 있습니다. 분자량과 분자 크기의 분포가 넓은 샘플일 경우 각도 의존성을 보이는 큰 분획과 그렇지 않은 작은 분획이 혼재할 수 있습니다. 이 경우, Rg는 더 먼저 용출된 큰 분자에 대해서만 계산할 수 있습니다.

이러한 행동을 강조하는 예가 그림 2에 나와 있습니다. Rh와 Rg 값을 직접 계산할 수 있는 데이터 부분은 진한 녹색과 자주색 플롯의 실선 구간으로 표현됩니다. 선의 점선 부분은 Rh와 Rg 값이 외삽된 영역을 나타냅니다. 샘플에서 계산할 수 있는 가장 작은 Rg 값은 11.55 nm이며, 이는 샘플의 나중에 용출된 분획이 각도 의존성을 보이기에는 너무 작은 지점입니다. 이로 인해 샘플의 큰 부분에서 Rg가 외삽됩니다. 반대로 Rh는 5.08 nm까지 계산될 수 있어 샘플의 대부분에 대한 분자 크기를 직접 계산할 수 있습니다.

Rh와 Rg는 샘플의 서로 다른 속성을 나타내므로, 이러한 값들이 같을 것으로 예상해서는 안 됩니다. 이는 두 값 중 하나가 틀렸다는 것을 의미하지 않습니다! 주어진 샘플 유형과 용매에 대해 두 값 사이의 일관된 관계가 있을 것입니다. 고분자 샘플에 대한 제 경험에 따르면 (단백질의 경우 Rg 데이터를 얻기 어려우므로) 계산된 Rg는 일반적으로 측정된 Rh보다 약간 크지만 같은 범위 내에 있습니다(그림 2의 예시에서는 Rh = 13.62 nm; Rg = 14.19 nm). 이 관계는 모든 경우에 적용될 필요는 없으며, Rh와 Rg 간의 관계는 분자 구조에 따라 달라집니다.

분자 크기는 다양한 이유로 과학자들에게 중요합니다. 가능한 데이터를 사용하여 샘플에 가장 적합한 방식으로 사용하시길 권장합니다. 다음 번에 GPC/SEC 데이터를 발표할 때 누군가가 Rh와 Rg의 차이에 대해 물어본다면 준비가 되어 있을 것입니다!

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