새로운 waveRAPID 동역학 분석으로 제약 적중물질 발견의 한계를 확장

요약

수천 개의 화합물에 대한 약물 발견 고처리량 선별 캠페인에서는 약물 표적과의 잠재적인 상호작용을 보여주는 다수의 적중물질이 생성될 수 있습니다. 결합 친화도는 많은 고처리량 분석에서 정상 상태 분석을 통해 도출될 수 있습니다. 추가 개발이 가능한 적중물질을 선택하려면 결합 동역학의 전체 특성 분석이 필요합니다. 이를 통해 유리한 동역학적 결합 속도로 원하는 표적에 특이적으로 결합하는 화합물을 식별할 수 있습니다. 실제로 이는 다수의 선별 유효물질에 대해 광범위한 동역학 연구를 수행해야 함을 의미합니다. 현재까지 이는 시간 및 물질이 많이 소모되는 작업이었습니다. 수백 개의 유효물질을 사용하여 적합한 희석 시리즈를 준비해야 하며 각 농도로 복제물에 주입해야 합니다. Creoptix는 이러한 프로젝트를 훨씬 더 효율적으로 만들어 단일 농도의 샘플에서 강력한 동역학 특성 분석이 가능한 새로운 기술을 개발했습니다. Creoptix WAVE의 Creoptix waveRAPID는 선별 상황에서 동역학 측정에 대한 패러다임 변화를 나타냅니다.

당사 고객인 Idorsia Pharmaceuticals Ltd의 HTS 약물 발견 그룹에서 실시한 이번 연구에서는 다수의 약물 유효물질의 동역학 특성 분석을 간소화하는 waveRAPID의 유용성을 보여줍니다. 여러 실험에서 waveRAPID를 사용하여 최대 146개 유효물질의 결합 동역학이 이전에 센서 매트릭스에 고정되었던 약물 표적에 단일 농도로 펄스 주입된 샘플을 사용하여 측정되었습니다. 분석된 화합물은 모두 기존의 다주기 동역학 측정을 사용하여 첨단 SPR 기기를 통해 이전에 연구된 것입니다. 

두 기술을 통해 얻은 데이터를 비교했을 때 계산된 해리 상수(K_D)와는 몇 개의 이상치를 제외하고 우수한 상관관계가 있는 것으로 나타났습니다. 이 결과는 초기 약물 발견 시 Creoptix WAVE의 waveRAPID 기술을 검증하여 선별 상황에서 고처리량으로 심층적인 동역학 데이터를 생성할 수 있게 합니다. 각 화합물의 특성 분석 시간이 단 몇 분으로 단축되므로 상당한 시간 및 재료 절감 효과를 얻을 수 있습니다. 수백 개의 화합물의 결합 동역학을 측정하기 위한 대규모 캠페인을 최신 SPR 기기와 비교하여 몇 주가 아닌 며칠 만에 수행할 수 있습니다. 

또한, waveRAPID 기술은 분석 시리즈 전체에서 까다로운 화합물(예: 높는 벌크 굴절률 기여도 또는 느린 해리성을 나타내는 화합물)에서도 완강한 데이터를 생성했습니다. 이러한 화합물은 리간드 단백질의 표면 재생과 재고 정화를 필요로 하는 경우가 많습니다. 이로 인해 기존의 다주기 분석을 사용한 대규모 측정 캠페인에서는 워크플로가 중단됩니다. 마지막으로, Creoptix WAVE와 새로운 waveRAPID 방법은 매우 간단한 분석 설정이 가능하여 샘플별 단일 농도에서 전체 결합 동역학 분석을 제공합니다. 또한 통계적 매개 변수 추정에 기반한 Creoptix의 독창적이고 새로운 평가 엔진인 Direct Kinetics는 실제 통계 오차 계산을 포함한 자동화되고 견고한 분석 워크플로를 제공합니다. waveRAPID 기술과 Direct Kinetics 자동 평가 엔진은 오늘날 초기 약물 발견에서 동역학적 결합 분석을 수행하는 방식을 혁신시킬 수 있는 강력한 패키지를 대표합니다.

실험방법

Creoptix 프로토콜

이전에 Ni²⁺ 이온이 로딩된 4PCP-NTA WAVEchip에 히스티딘 표지 표적 단백질 1 및 히스티딘 표지 표적 단백질 2를 4000~5000pg/mm² 농도로 포획했습니다. 화합물을 10μm 샘플 용액으로부터 25초 동안 waveRAPID 펄스 주입한 후, 완충액을 유동 셀당 32.5μl/min의 유량으로 250초 동안 주입했습니다. 모든 측정은 0.05% Tween-20 및 5% DMSO를 사용하여 50mm 포스페이트 완충액에서 수행했습니다. 데이터는 참조 채널 및 빈 주입의 신호를 차감하여 이중 참조했습니다. 6회 주입 펄스에 대한 감지 영역 내 화합물의 겉보기 농도를 화합물 샘플과 동일한 주입 매개 변수를 사용하여 0.5% DMSO를 추가로 보충한 실행 완충액의 펄스 주입으로 보정했습니다. 동역학 분석은 Direct Kinetics 추정 엔진에서 1:1 결합 모델을 사용하여 수행했습니다.

Biacore 프로토콜

이전에 Ni²⁺ 이온으로 활성화된 Ni-NTA 칩에 히스티딘 표지 표적 단백질 1 및 히스티딘 표지 표적 단백질 2를 4000~5000pg/mm² 농도로 포획했습니다. 분석물은 실행 완충액(0.05% Tween-20 및 5% DMSO를 사용한 50mM 포스페이트 완충액)에서 일련의 희석을 통해 원하는 농도로 조정되었습니다. 센서그램은 결합 시간 100초, 해리 시간 250초, 유량 40μl/min에서 기록했습니다. 결합 동역학(k_on, k_off 및 K_d)을 측정하기 위해 Biacore T200 Evaluation 소프트웨어에서 1:1 결합 모델을 사용하여 이중 참조 후 얻은 센서그램을 분석했습니다.

결과

선별과 같은 상황에서 동역학적 결합 데이터를 빠르게 획득하기 위한 새로운 waveRAPID 기술이 본 연구에서 최첨단 기기 및 방법론에 대해 검증되었습니다. 그림 1에서 볼 수 있듯이 각 샘플을 단일 농도로 펄스 주입하여 다수의 선별 유효물질에 대한 동역학적 결합 데이터를 신속하게 생성할 수 있습니다. 분석물 해리성을 포함하여 각 측정에는 약 5분이 소요되었습니다. waveRAPID에 의해 생성되는 일반적인 반응 프로파일은 그림 1, 패널 A 및 B에 표시되어 있습니다(데이터는 빨간색, 동역학 1:1 모델은 검은색). 평가된 매개 변수는 패널 C의 비율 맵에 표시되어 있으며(검은색 원 안의 전체 분석에 주입된 대조 화합물), 재현성이 탁월함을 보여줍니다. 표 1에는 두 표적에 대한 예시적 분석과 384개 샘플을 비교한 일반적인 분석 시간 및 샘플 처리량이 나와 있습니다. 

그림 1: 새로운 waveRAPID 기술을 사용하여 초기 약물 유효물질 발견 및 특성 분석을 위해 Creoptix WAVEdelta에서 GCI 적용. 선별 상황에서 전체 동역학적 특성 분석이 waveRAPID를 사용하여 단일 농도로 주입된 화합물로부터 도출될 수 있으므로, 초기 약물 유효물질 발견 시 많은 시간과 비용을 절감할 수 있습니다.
(a) 80개 화합물을 선별할 때 일단의 대표 waveRAPID 반응 프로파일이 표시됩니다.
(b) WAVEcontrol의 선택 가능한 사전 설정에서 맞춤형 주입 설정을 사용하면 전체 범위의 친화도를 커버할 수 있습니다. 이 경우 중간 결합제 설정(20초 펄스 주입, 250초 해리)을 사용하여 낮은 나노몰에서 낮은 마이크로몰까지 친화도를 측정할 수 있습니다.
(c) 동역학적 속도는 대각선에서 동일한 친화도를 갖는 속도 맵에 표시됩니다. 원 안의 데이터 포인트는 전체 분석에서 대조 화합물의 우수한 재현성을 보여줍니다.

표 1: 2개 표적에 대한 384개 샘플의 전체 동역학 특성 분석을 위한 WAVEdelta의 waveRAPID와 최첨단 기술(Biacore T200, 8k)을 비교한 예시적 분석 실행 시간 및 샘플 처리량.

획득된 동역학 데이터는 결합 속도 오차(절대 k_a의 100% 미만 및 절대 k_d의 50% 미만)에 대해 필터링되었으며 표준 SPR 다주기 측정의 데이터와 비교되었습니다. 그림 2에서 볼 수 있듯이, 기존의 SPR 다주기 측정치와 비교한 결과 두 데이터 세트 간의 상관 관계가 매우 양호한 것으로 나타났습니다. 

그림 2: Creoptix WAVEdelta의 wavRAPID로 측정한 약물 선별 유효물질 결합 동역학은 Biacore T200 기기에서 수행된 기존의 다주기 동역학 측정에서 얻은 값에 대해 플롯되었습니다. waveRAPID 데이터는 계산된 속도 매개 변수의 100% 미만 결합 속도(k_a) 및 계산된 속도 매개 변수의 50% 미만 해리 속도(k_d)에 대해 통계적 오차가 필터링되었습니다. 이 상관 관계를 통해 기존 방법에 비해 10배 더 빠른 waveRAPID 동역학 방법이 검증됩니다.

시스템을 추가로 시험하기 위해, 기존의 다주기 측정에서 워크플로 중단 및 표면 재생을 유발하는 보다 어려운 화합물이 분석 전체에 실행되는 또 다른 측정 시리즈가 수행되었습니다. 분석물과 표적 단백질의 접촉 시간이 상당히 짧기 때문에 이러한 어려운 분자(높은 대량 반응 또는 느린 해리를 보임)는 WAVE에서 전체 작업 흐름을 중단하지 않으며 간헐적 표면 재생이 전혀 필요하지 않습니다. 그림 3에서 볼 수 있듯이, 거의 모든 관심 화합물의 동역학적 결합 매개 변수는 여전히 낮은 오차로 완강하게 평가될 수 있었고 양성 대조에서도 여전히 높은 재현성을 보였습니다.

그림 3: 이전에 특성 분석된 30개 화합물이 높은 대량 굴절률(RI) 기여도 또는 느린 해리성을 보여주는 30개의 까다로운 화합물과 분석 전체에 주입된 까다로운 화합물이 포함되어 있는 분석에서 다시 측정되었습니다. 까다로운 화합물로 인해 기존의 다주기 동역학에서는 중대한 워크플로 제한이 초래되어 정기적인 표면 재생이 필요한 반면, waveRAPID는 지속적인 무인 측정 시간으로 원활한 워크플로가 가능했습니다. Creoptix Direct Kinetics 평가 엔진에 의해 계산된 절대 결합 및 해리 상수의 통계 오차(%)가 각각 수평 및 수직 축에 플롯됩니다. 이전 분석에서 어려운 거동을 보이지 않은 화합물(녹색 표시)과 대조물질 복제물(자주색 표시)은 낮은 오차로 명확하게 식별됩니다. 또한 이전 분석에서 벌크 굴절률 기여도가 커서 어려움을 보인 화합물은 WAVE에서 오차(파란색 표시)가 적은 상태로 완강하게 분석할 수 있습니다. 분석하기 어려운 나머지 화합물은 더 큰 오차(빨간색 표시)로 명확하게 특성화 분석됩니다.

결론

높은 감도, 매우 빠른 상호 작용 분해 능력 및 waveRAPID 분석 기술을 갖춘 WAVEsystem을 사용하면 기존의 다주기 동역학 분석에 비해 훨씬 짧은 시간 내에 다수의 약물 유효물질에 대한 동역학 특성 분석이 가능합니다. 한 번의 주입으로 단일 웰에서 동역학을 획득함으로써 시약 및 샘플 소비가 줄어들어 초기 약물 발견에 상당한 이점을 얻을 수 있습니다. 또한, waveRAPID에는 다음과 같은 장점이 있습니다.

• 훨씬 짧은 시간에 기존 SPR과 비교할 수 있는 결과를 제공
• 접촉 시간을 단축하여 표적 단백질을 보존하고 더 오랜 시간 중단 없는 분석을 지원
• 재현성 및 신뢰성 높은 결과를 제공
• 관련 매개 변수에 기반한 유효물질 선택으로 단일 주입에서 결합 동역학을 측정
• 몇 주가 아닌 며칠 만에 더 많은 상호작용을 특성 분석
• 고도의 통계 오차 계산을 통해 관련 유효물질을 발견하고 문제가 있는 화합물을 필터링

핵심 내용

• 단축된 샘플 접촉 시간이 표적 무결성을 유지하여 더 긴 실행이 가능
• 한 번의 주입으로 결합 동역학을 측정
• 재현성이 우수하고 기존 SP 기술과 비교할 수 있는 측정 결과

적합한 용도:

• 원액 혼합물 선별: 소분자, 단편 및 펩타이드
• 빠른 선도물질 진행 과정
• 선도 물질 최적화
• 불안정한 대상
• 까다로운 화합물
  

공지 사항

모든 실험을 수행하고 이 문서에 기여해 주신 Geoffroy Bourquin, Laksmei Goglia, Solange Meyer 및 Oliver Peter에게 감사드립니다.