원액 반응 혼합물의 선별

이 기술노트에서는 어떻게 Creoptix WAVE가 단편 기반 약물 발견에서 적중 최적화를 지원하는 신뢰할 수 있는 환경을 제공하는지 설명합니다. WAVEsystem은 높은 감도와 완강한 미세유체 덕분에 Biacore T200 측정치와 매우 일치하는 동역학 데이터를 제공합니다. 이는 피루베이트 디히드로게나제 키나아제 2(PDHK2) 및 열충격 단백질 90(HSP90)의 선택적인 강력한 억제제를 식별하기 위한 후향적으로 측정된 Vernalis 캠페인을 통해 확인할 수 있습니다.

서론

단편 선별은 약물 발견 프로세스에서 초기 유효물질을 식별하기 위한 강력한 접근법으로 부상하고 있습니다. 주요 특징은 적은 수(1000s)의 저분자량(일반적으로 <250 Da) 화합물의 표적 결합이 선별된다는 것입니다. 화합물의 크기가 작다는 것은 화합물이 결합될 가능성이 높지만 친화도가 약하다는 것을 의미하며, Creoptix 센서를 비롯한 다양한 생물물리학적 접근법을 사용할 수 있습니다. 대부분의 표적에서 대부분의 결합 부위에 결합되는 단편을 식별하는 것은 비교적 간단합니다. 문제는 약물 특성에 대한 최적화를 시작하기 전에 단편을 더 높은 친화도를 가진 더 큰 유효물질로 증식하는 것입니다.

표적(리간드, L)에 대한 화합물(분석물, A) 결합의 친화도는 다음과 같이 단순 평형 상태를 가정합니다.

[Formula 1 TN201001-Creoptix-screening-crude-reaction-mixtures.jpg] Formula 1 TN201001-Creoptix-screening-crude-reaction-mixtures.jpg

여기서 kd는 해리 속도, ka는 결합 속도이고, 평형 해리 상수 또는 친화도(KD)는 비율 kd/ka입니다. 많은 경우, 화합물에 대한 수정으로 인해 해리 속도가 느려질 때 친화도가 향상됩니다. 이는 1차 속도 상수이므로 농도와 무관합니다.

기존의 최적화 접근법은 개별 반응으로 각 화합물을 합성하고 정제한 후 분석법에서 친화도를 측정하기 전에 정의된 농도에서 화합물을 구성하는 과정을 수행해야 합니다. Vernalis는 합성의 속도 및 비용을 크게 개선하여 화합물 친화도를 개선할 기회를 모색하는 원액 반응 혼합물(CRM)을 선별하는 방식을 개척했습니다. 유효물질의 경우 일련의 반응은 일반적으로 판 기반 형식으로 병렬 수행되어 유효물질에 통합된 치환기를 변경합니다. 최소 작업 후 결과 원액 반응 혼합물이 표적에 결합하기 위한 해리 속도 변화를 개별적으로 평가합니다. 해리 속도의 변화는 향상된 친화도의 화합물을 얻었음을 나타냅니다. 이러한 해리 속도 선별(ORS)1의 초기 시연에서는 Biacore 기술을 사용하여 물질, 관련 폐기물 처리 및 시간 측면에서 효율성이 향상되었음을 입증했습니다. 또한 구조-활성 관계(SAR)에 대한 이해가 낮은 경우 프로젝트 초기 단계에서 더 많은 화합물의 순위를 빠르게 지정할 수 있습니다.

이 접근법의 핵심은 해리 속도의 변화를 안정적으로 감지하는 능력입니다. 독점 도파관 간섭법(GCI) 기술은 표면 플라즈마 공명(SPR)과 같은 종래 기술에 비해 뛰어난 감도를 제공하여 최대 10s-1의 해리 속도를 안정적으로 측정할 수 있습니다. 또한 Creoptix WAVE의 막힘 없는 미세유체는 아세토니트릴 및 고농도 DMSO를 포함한 다양한 용제를 허용하여 원액 반응 혼합물에 사용할 수 있는 화학 물질의 범위를 확대합니다.

이 기술노트에서는 Creoptix WAVE로 얻은 ORS 결과를 이전에 Vernalis가 Biacore 기기에서 두 개의 표적인 피루베이트 디히드로게나제 키나아제 2(aa16-407)(이하 PDHK2로 지칭) 및 PDHK2 및 열충격 단백질 90α(a9–236)의 N-말단 ATPase 도메인(이하 Hsp90으로 지칭)에 대해 동일한 CRM 라이브러리를 사용하여 후향적으로 얻은 결과와 비교했습니다. Vernalis는 GHKL ATPase 계열의 멤버 모두에 대한 일련의 강력한 억제제를 식별했습니다.2,3,4

실험방법

원액 반응 혼합물(CRM)에 대한 해리 속도 선별. WAVEdelta에서 CRM 83개 및 정제된 대조 화합물 1개에 대해 해리 속도를 선별했습니다. 표적 단백질을 포획하기 전에 PCH-NTA WAVEchip에 니켈 클로라이드를 로딩했습니다. 두 개의 His6 표지 HSP90과 두 개의 His6 표지 PDHK2 단백질을 각각 채널 2 및 3에서 약 7000pg/mm2로 포획했습니다. 채널 1 및 4는 니켈이 로딩되었으며 참조 채널로 사용되었습니다. CRM을 HBS-P + 1% DMSO에서 약 20μm 농도로 30초간 약 250μl/min의 일정한 유량으로 주입했습니다. 120초간 해리가 허용되었습니다. 오프셋 측정은 WAVEcontrol 소프트웨어를 사용하여 수행했습니다.

정제 화합물 동역학

단백질을 포획하기 전에 PCH-NTA WAVEchip에 0.5mM NiCl2을 로딩했습니다. HSP90 및 PDHK2를 HBS-P 완충액에서 약 3,500pg/mm2 밀도로 포획했습니다. VER235377(정제 화합물)을 27.4nM ~ 20μm 범위의 농도(7개 농도, 3배 희석)로 HBS-P + 1% DMSO에서 30μl/min으로 주입했습니다. 60초간 주입 후 60초간 해리 단계가 허용되었습니다. 모든 상호작용 분석은 25°C에서 수행했으며 데이터 평가에는 WAVEcontrol을 사용했습니다. Langmuir 1:1 모델을 데이터 피팅에 사용했으며 동역학 매개 변수를 결정했습니다.

결과

Vernalis는 유효물질 대 선도물질 화학 공간에서 동역학적으로 샘플을 채취하는 데 해리 속도 선별(ORS) 사용을 개척해 왔습니다.1 화학정보학, 화합물 라이브러리 합성 및 표면 플라즈마 공명(SPR) 분석 분야의 전문성은 이 벤치마크 연구에서 매력적인 것으로 확인되었으며 미정제 반응물(CRM)의 ORS를 가능하게 했습니다. CRM 선별은 화합물 라이브러리의 정제 또는 단백질 구조의 사용 없이 절편 유효물질에서 선도물질을 신속하게 식별합니다. 한 비교 ORS 연구에서 WAVEdelta(GCI 기술 기반)와 Biacore T200(SPR 기술 기반)을 사용하여 두 기술을 대조했습니다. 특히 선택된 화합물은 WAVEdelta에서 측정되고 Vernalis의 Biacore T200에서 후향적으로 테스트된 CRM 라이브러리와 비교되었습니다. 

그림 1은 선택된 CRM의 해리 속도 측정 예를 보여줍니다. 두 실험 모두에서 Creoptix WAVEdelta에서 얻은 결과가 Biacore T200에서 얻은 결과와 일치했습니다. 해리 속도가 1s-1을 넘는 화합물에 대해 WAVEdelta는 매우 빠른 해리 상수(koff)를 신뢰성 있게 측정할 수 있었습니다.

[Figure 1 TN201001-Creoptix-screening-crude-reaction-mixtures.jpg] Figure 1 TN201001-Creoptix-screening-crude-reaction-mixtures.jpg

그림 1: 선택된 CRM의 해리 속도 선별 측정은 Biacore T200(왼쪽 패널) 또는 Creoptix WAVEdelta(오른쪽 패널)에서 수행되었습니다. GCI 데이터는 SPR 데이터를 재현하며 1s-1보다 빠른 상호작용의 해리 속도를 정확하고 보다 신뢰성 있게 측정할 수 있습니다.

이 해리 속도 선별 연구는 WAVEdelta에서도 정제 화합물(VER235377)로 특성 분석된 동일한 PDHK2 선택적 유효물질을 식별했습니다. 동역학 매개 변수 및 결합 친화도는 SPR 기반 Biacore T200에서 얻은 매개 변수와 유사했습니다. 그림 2는 GCI Creoptix WAVEdelta(오른쪽 패널) 및 SPR(Biacore T200, 왼쪽 패널)에서 얻은 데이터를 보여줍니다. 마지막으로 동일한 PDHK2 선택적 유효물질(VER235377)을 식별했습니다.2,4 획득된 동역학 데이터는 표 1에 나와 있습니다.

kon(M-1.s-1) koff(s-1) Rmax(pg/mm2) KD(nM)
HSP90 Biacore T200 1.92x105 0.130 24.1 679
HSP90 WAVEdelta 1.82x105 0.122 25.2 669
PDHK2 Biacore T200 6.10x105 0.116 18.3 191
PDHK2 WAVEdelta 3.16x105 0.052 14.5 166

표 1: HSP90 및 PDHK2를 통한 정제 화합물 VER235377의 동역학 데이터

[Figure 2 TN201001-Creoptix-screening-crude-reaction-mixtures.jpg] Figure 2 TN201001-Creoptix-screening-crude-reaction-mixtures.jpg

그림 2: 정제 화합물 VER235377의 결합 동역학 데이터 측정은 Biacore T200(왼쪽 패널) 또는 Creoptix WAVEdelta(오른쪽 패널)에서 수행되었습니다. 단백질 HSP90 및 PDHK2에 대해 비교 가능한 데이터가 얻어졌습니다.

요약하면 Creoptix WAVE에서 다음이 가능했습니다.

  • 이전에 Biacore T200 PDHK2를 사용하여 보고 및 측정된 유효물질을 확인2,4
  • 동일한 PDHK2 선택적 유효물질 VER235377을 확인하고 완전히 정제된 형태로 특성 분석
  • HSP90에 대한 VER235377 PDHK2 선택성을 확인
  • 1s-1보다 훨씬 큰 해리 속도를 가진 화합물에 대해 우수한 분해능을 보여 빠른 해리 속도를 판별하는 Creoptix WAVE의 능력을 입증

결론

Creoptix WAVE 는 피루베이트 디히드로게나제 키나아제 2(PDHK2) 및 열충격 단백질 90(HSP90)에 대해 후향적으로 측정된 Vernalis 화합물 캠페인을 통해 얻은 결과에서 보듯이 Biacore T200 측정치와 매우 일치하는 동역학 데이터를 제공합니다. 매우 빠른 상호작용을 판별할 수 있는 고감도 기능을 갖춘 Creoptix WAVE는 화합물 선별 및 소분자의 동역학 분석을 개선하여 약물 개발을 가속화하고 표적 및 화합물 정제와 관련된 비용을 크게 절감합니다. 따라서 WAVE는 소분자, 단편, 펩타이드 등과 같이 매우 빠른 해리 속도를 보이는 약한 결합체 라이브러리를 선별하는 데 이상적입니다. WAVE는 미정제 원액 반응 혼합물을 연구할 수 있는 막힘 없는 미세유체 기술과 결합되어 약물 발견 프로세스를 혁신하고 가속화합니다.

핵심 내용

Creoptix WAVEsystem을 사용하여 원액 반응 혼합물에서 약하게 결합되는 화합물의 빠른 해리 속도를 포착합니다.

  • 원액 반응 혼합물과 호환되는 막힘 없는 미세유체: 해리 속도 선별 및 단편 기반 약물 설계에 이상적입니다.
  • SPR 기록 데이터와 비교할 수 있는 데이터: GCI 기술은 SPR 기반 기기를 통해 얻은 것과 유사한 동역학 데이터를 제공합니다.
  • 1s-1보다 훨씬 높은 해리 속도 측정: WAVEsystem은 빠른 전환을 통해 최대 10s-1의 해리 속도까지 측정합니다.

적합한 용도:

  • 원액 혼합물의 해리 속도 선별: 소분자, 단편 및 펩타이드
  • 빠른 선도물질 진행 과정
  • 선도 물질 최적화

참고 문헌

  1. Murray, J.B. et al. 2014. Off-Rate Screening (ORS) By Surface Plasmon Resonance. An efficient method to kinetically sample hit to lead chemical space in unpurified reaction products. J. Med. Chem. 57, 2845-1850 doi: /10.1021/jm401848a
  2. Brough, P.A. et al. 2017. Application of Off-Rate Screening in the Identification of Novel Pan-Isoform Inhibitors of Pyruvate Dehydrogenase Kinase.J. Med. Chem., 60, 6, 2271–2286. doi: 10.1021/acs.jmedchem.6b01478
  3. Brough, P. A. et al. 2009. Combining hit identification strategies: fragment-based and in silico approaches to orally active 2-aminothieno[2,3-d]pyrimidine inhibitors of the Hsp90 molecular chaperone. J. Med. Chem. 52, 4794–4809 doi: 10.1021/jm900357y
  4. Baker, L .M. et al. Rapid optimization of fragments and hits to lead compounds from screening of crude reaction mixtures. Commun Chem 3, 122 (2020).doi: 10.1038/s42004-020-00367-0

공지 사항

모든 실험을 수행해주신 Natalia Matassova 박사(Vernalis)와 이 기술노트에 기여한 Roderick Hubbard 교수에게 감사드립니다.

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