진화된 나노입자 추적: 향상된 프레임 속도 및 분해능을 가진 NanoSight Pro

소개

나노입자 추적 분석(NTA) 은 브라운 운동을 시각화하고 분석하여 현탁액 내 나노입자의 특성을 파악하는 데 사용하는 강력한 기술입니다. 이 방법은 고급 광학 현미경과 정교한 소프트웨어를 활용하여 개별 입자의 움직임을 추적하여 입자 크기 분포, 농도 및 역학에 대한 자세한 정보를 제공합니다.

NTA에서 가장 중요한 부분은 카메라 시스템의 성능, 특히 프레임 속도와 분해능입니다. 초당 프레임 수(fps) 즉, 프레임 속도는 입자 추적 정확도와 분석의 시간 분해능에 직접 영향을 미치는 이미지 캡처 횟수를 결정합니다. 그리고카메라 분해능은 각 프레임에 담기는 세밀함의 수준을 정의합니다.

프레임 속도와 분해능의 균형을 맞추는 것은 NTA 성능을 최적화하는 데 필수적이며, 광범위한 나노 입자 크기 및 농도에서 신뢰할 수 있고 재현 가능한 결과를 보장합니다.

이 기술 노트에서는 가변 프레임 속도와 카메라 분해능이 NTA에 미치는 영향을 살펴보고, NanoSight Pro를 통해 최적의 분석 결과를 얻기 위해 카메라 및 녹화 조건을 선택하고 구성하는 모범 사례에 대한 통찰력을 제공합니다.

NTA 원칙

NanoSight 제품 라인을 사용한 나노입자 추적 분석(NTA)은 광 산란 및 브라운 운동의 특성을 활용하여 현탁액 내 고분해능 입자 크기 분포를 측정합니다. 레이저 모듈과 결합된 상단 플레이트에 시료를 투입한 후 레이저 빔을 쏘면 입자가 빛을 산란시킵니다. 그런 다음, 프레임 단위로 입자의 평균 제곱 변위(MSD)를 볼 수 있는 고감도 카메라와 20배율 대물렌즈를 통해 이 광선을 관찰할 수 있습니다. 이는 다시 온도(T)와 점도(η)를 고려하여 Stokes-Einstein 방정식(아래 참조)을 통해 수화 지름(hydrodynamic diameter)으로 변환됩니다. 

분석 과정에는 다음 과정이 포함됩니다. 

1. 브라운 운동 입자의 동영상을 녹화합니다
2. 프레임 단위로 각 입자의 움직임을 추적합니다 
3. 아래와 같이 농도 대비 크기를 플로팅하기 위해 데이터를 처리합니다(그림 1)

이미지 최적화 

카메라 설정

캡처된 동영상의 품질은 안정적이며 신뢰할 수 있는 데이터를 얻는 데 필수적입니다. 따라서 정확한 추적 결과를 얻으려면 이미지 및 카메라 설정을 위한 최적의 조건을 이해하는 것이 필수적입니다. 이상적인 설정은 깨끗하고 어두운 배경에 명확하고 선명한 점들이 나타나는 것입니다. 

NanoSight Pro는 자동 및 수동 카메라 설정 옵션을 모두 제공하여 사용자가 두 가지 주요 매개변수(노출 시간 및 명암비)를 조정할 수 있도록 지원합니다. 

• 노출 시간은 카메라의 전자 셔터가 열려 있는 시간을 결정하여 입자에서 포착되는 빛의 양을 제어합니다. 이 설정은 프레임 속도에 직접 영향을 미칩니다. 
• 대비 이득은 카메라 감도를 향상하기 때문에 샘플에 존재하는 가장 작은 입자를 확인하고 추적 및 분석할 수 있도록 높여야 합니다. 

노출 시간, 명암비, 프레임 속도 간의 관계는 초당 25프레임의 고정 카메라 속도로 작동하고(아래에서 설명) 카메라 레벨을 조정하는 기존 시스템에 비해 상당한 개선되었음을 나타냅니다.

촬영 시간: 초에서 프레임으로

NanoSight 제품 라인은 수년간 25fps의 고정 카메라 속도로 작동했습니다. 이전에는 더 많은 다분산계 샘플 또는 희석된 샘플에 대해 최적의 데이터 포인트 수를 캡처하기 위해 녹화 시간을 초 단위로 조정하는 것이 일반적으로 권장되었습니다. 예를 들어 60초 이상 녹화는 일반적으로 대부분의 다분산계 또는 희석 샘플에 대해 활용되는 SOP였습니다.  이 접근 방식을 통해 크기 분포에 걸쳐 구간(bin) 크기당 통계적으로 관련된 기준점을 수집할 수 있었습니다. 반대로, 비교적 단분산계인 샘플에는 더 적은 녹화 시간으로도 충분했습니다. 

새로운 NanoSight Pro 및 NS Xplorer 소프트웨어(그림 2)는 각 동영상의 총 재생 시간에 초점을 맞추는 방식에서 프레임 속도를 가변적으로 활용하는 방식으로 전환했습니다. NTA는 브라운의 운동 동작을 통계적으로 더 잘 이해하기 위해 여러 프레임 위에 있는 각 입자의 위치를 추적합니다. NS Xplorer는 이제 동일한 통계적 유의성을 유지하면서 프레임 속도를 조정하여 NS300과 이전 모델에 비해 짧은 시간에 동영상을 녹화할 수 있습니다. 가변 프레임 속도 범위는 이전 NanoSight 모델의 고정 25fps와는 달리 25fps에서 65fps까지 다양합니다. 프레임 속도는 노출 시간 설정에 따라 결정됩니다. 아래 그림과 같이 노출 시간이 짧을수록 프레임 속도가 높아집니다.

예제 데이터에는 다음이 포함됩니다.

• 최대 노출 시간 40ms = 25fps
• 노출 시간 23.7ms = 42fps
• 노출 시간 15ms 이하 = > 65fps

노출 시간과 프레임 속도 간의 관계는 동영상의 총 녹화 시간으로 이어집니다. 다음은 카메라 노출 시간에 따라 총 1,500 프레임을 캡처하는 데 걸리는 시간이 달라지는 그림입니다. 

다음 두 가지 시나리오를 살펴보면서 다시 정리해 보겠습니다.

1. 농도가 낮거나 입자가 흐릿하면 다음과 같은 조건 설정을 생각해 보십시오.
   긴 노출 시간 = 낮은 프레임 속도 = 더 긴 동영상 시간
   
   
2. 농도가 더 높거나 밝은 입자 가 있는 경우 다음과 같은 조건 설정을 생각해 보십시오.
   짧은 노출 시간 = 높은 프레임 속도 = 짧은 동영상 시간. 

녹화당 750개 프레임은 대부분의 샘플 유형이 통계적으로 강력한 분석을 생성하기에 충분하므로 실제 녹화 시간은 10~30초입니다.

이 이론 및 방법을 자동 설정으로 확장한다면, 산란 모드의 기본 자동 설정은 다음과 같은 경우 750프레임입니다.
25fps에서 = 30초
65fps에서 = 11초

형광 모드 측정의 경우 프레임 속도가 높으면 단 150프레임만 사용하여 광표백(photobleaching) 샘플에서 충분한 신호를 얻을 수 있습니다.
25fps에서 = 6초
65fps에서 = 2.3초

녹화당 프레임 수의 기본값은 사용자가 언제든지 조정하여 충분한 입자 트랙이 생성되도록 하고 통계적으로 중요한 데이터를 얻을 수 있습니다.

카메라 - 새로운 기능

완벽하게 어두운 배경에서 흰색 점을 완벽하게 촬영하는 것은 성공적인 추적의 한 가지 구성 요소일 뿐입니다. 다음 단계는 소프트웨어가 배경에서 입자에서 발생하는 산란광을 구별할 수 있는 능력과 관련되어 있습니다. 주변 환경과 비슷한 밝기 수준을 가진 가장 작고 희미한 입자의 경우 구별하기가 어려울 수 있어 알고리즘이 이를 감지하고 추적하기가 어렵습니다. 이 경우 카메라 분해능을 최대한 활용하는 것이 매우 도움이 됩니다.

NanoSight Pro와 달리, 구형 NanoSight 시스템은 8비트 그레이 스케일 값을 사용하였으며 아래 그림 5에 나와 있는 것처럼 흑백 사이에 256개의 회색 레벨(28=256)을 제공합니다. 새로운 NanoSight Pro는 카메라의 기본 12비트 분해능의 모든 기능을 활용합니다. 이렇게 하면 흑백 사이에 4,096개의 회색 레벨(212=4096)을 사용할 수 있습니다(그림 5).

12비트 카메라 분해능을 4,096개 색상의 크레용이 들어 있는 상자라고 생각해 보겠습니다. 각 크레용은 카메라가 캡처할 수 있는 다양한 색상을 나타냅니다. 크레용을 더 많이 사용할수록 그림은 더 세밀해지고, 미묘한 차이를 표현할 수 있습니다. 이와 같은 방식으로 12비트 카메라는 4,096가지의 다양한 밝기 수준을 캡처할 수 있어 밝은 영역과 어두운 영역의 미세한 차이를 구분할 수 있습니다. 이러한 높은 수준의 세밀함은 특히 나노입자 추적 분석에서 작고 희미한 입자를 감지하고 분석하는 데 유용합니다.

이는 NS300의 16배의 그레이 스케일 분해능을 제공합니다. 분해능은 이미지 처리에 어떤 영향을 미칠까요? 소프트웨어는 회색 수준에서 미세한 변동을 감지할 수 있으므로 시스템이 더 희미한 입자와 소음에 의해 부분적으로 가려지는 입자를 감지할 수 있습니다. NanoSight Pro는 머신 러닝 모델 사용으로 입자 식별 능력이 보다 강화되었습니다. 아래 블로그에서 이 내용을 확인할 수 있습니다.

요약

NanoSight Pro는 높은 프레임 속도와 12비트 분해능을 구현하는 등 카메라의 잠재력을 최대한 활용하여 데이터 품질을 저하시키거나 입자 추적의 통계적 유의성을 훼손하지 않으면서 캡처 시간을 크게 단축합니다. 높은 프레임 속도로 빠르게 움직이는 입자도 정확하게 추적할 수 있고, 12비트 분해능으로 세밀하고 미묘한 입자 강도를 포착하여 가장 작고 희미한 입자도 감지할 수 있습니다. 이 결합을 통해 효율적이고 정밀한 나노입자 분석이 가능한 NanoSight Pro는 더 짧은 시간 안에 안정적이고 재현 가능한 결과를 원하는 연구자를 위한 강력한 도구입니다.

리소스:

• NanoSight Pro
• 나노 입자 추적 분석(NTA)
• 블로그: 걱정 없는 나노 입자 추적 분석! - NanoSight Pro에서의 머신 러닝 활용