대부분의 바이오 치료제는 단백질이거나 단백질 유도체이며 현재 시판 중이거나 개발 중인 바이오 약제에서 단일하면서도 가장 큰 규모의 종은 단일클론 항체(mAb)입니다. 항체의 특유한 결합 속성은 약학적으로 관련성 있는 대상 분자를 조절하여 질병을 관리하고 예방할 수 있는 기회를 바이오 제약 산업에 제공해왔습니다.
기존의 저분자 약제와 바이오 약제 사이의 주된 차이점은 후자의 경우 가공이 필요하고 액체 형태로 제공되어야 한다는 점입니다. 단백질은 용액 내에서 불안정한 것으로 악명 높기 때문에 이러한 바이오 치료 분자를 어떻게 제조하고 용액 내에서 분해 없이 장기간 보관할 수 있는지에 대한 접근법을 개발해야 합니다. 이는 바이오 제약 개발 및 제조에 있어 단백질 안정성 분석이 아주 중요함을 입증하는 부분입니다.
분명 용액 내 단백질의 수명이나 보관 수명을 평가하려면 실시간 안정성 분석이 필요합니다. 그러나 이는 시간이 소모하는 경우가 많기 때문에 안정적인 생물 약제 포뮬레이션 및 처리 조건을 개발하는 데 수반되는 학습 프로세스의 속도를 높이기 위해 더 빠른 예측법이 확립되었습니다.
이 중에서도 가장 일반적인 예측 접근법은 온도의 작용에 따라 단백질의 물리적 특성을 모니터링하는 열적 풀림 방법입니다. 이러한 데이터를 사용하면 단백질이 형태적 변화를 겪는 온도를 측정해 비교 연구에 활용할 수 있습니다. 이 분석법은 형태적 변화를 유발하는 데 더 높은 온도가 필요한 분자는 더 긴 보관 수명을 가지거나 더욱 안정적인 것으로 가정합니다. 그러나 여기에는 본 문서의 뒷부분에서 설명할 몇 가지 중요한 예외가 있습니다.
풀림 또는 열적 안정성 프로필은 지정된 조건에서 잠정적인 바이오 치료제의 내재적 안정성을 비교하기 위해 동일한 완충액에 든 여러 종류의 후보 약물에 대해 얻을 수 있습니다. 이러한 작업을 ‘후보 물질 선정’이라 합니다.
다양한 완충액과 공존 용질에서 모든 후보 분자에 대해 열적 안정성 프로필을 생성하면 안정화/불안정화 조건을 파악하는 데 도움을 줄 수 있습니다. 일반적인 포뮬레이션 첨가제 또는 부형제에는 아미노산, 당류, 폴리올, 염분, 세제가 포함되므로 이러한 물질이 분석에 간섭을 일으키지 않도록 주의를 기울여야 합니다. 이러한 유형의 테스트는 프리/포뮬레이션 및 공정 개발 그룹별로 수행됩니다. 후자의 목적은 크로마토그래피 처리와 바이러스 불활화 단계의 최적화를 위한 안정적인 로딩 및 용리 완충액을 파악함으로써 바이오 약제의 산출량을 극대화하는 정제 전략을 얻기 위함입니다.
시차 주사 열량측정법(DSC)과 같은 분석 기술은 정량화 성능이 더욱 우수하여 생물학적 동등성 및 비교 연구에도 사용됩니다.
앞서 언급했듯 형태적 변화를 유발하는 데 더 높은 온도가 필요한 것으로 보이는 분자는 더 긴 보관 수명을 가진다고 가정됩니다. 그러나 이러한 ‘경험적 법칙’은 변화를 모니터링하는 데 선택한 기법이 특정 형태적 반응이나 불활화 과정을 ‘감지하지 못하는’ 경우 잘못된 판단을 불러올 수 있습니다. 이는 다음 단백질 안정성 분석 플랫폼 구매 시 신중한 고려가 필요한 한 가지 이유입니다.
시장에는 단백질 안정성을 측정하기 위한 여러 가지 기술이 있습니다. 많은 제조업체들은 이러한 장비에서 생성한 데이터를 시차 주사 열량측정법(DSC)에서 얻은 결과와 비교함으로써 데이터의 품질을 입증하고 있습니다. DSC는 제조업체들이 자신의 기술을 측정하는 표준이며, 생물물리학 커뮤니티에서 DSC 데이터는 큰 신뢰를 받고 있습니다. 이러한 이유로 DSC는 종종 ‘절대적 표준’으로 언급됩니다.
한 고객의 말은 DSC의 활용성에 대해 다음과 같이 강조하고 있습니다.
“DSC는 가장 강력하고 가장 많은 정보를 제공하며 현재 이용 가능한 모든 생물물리학 방법과 관련성이 가장 높은 것 같습니다.”
Sorina Morar-Mitrica 박사 - GlaxoSmithKline, The BioProcessing Summit, 2012년
이러한 대체 기술이 우수한 데이터를 만들어낸다는 예시는 얼마든지 찾을 수 있지만 유용성이 떨어진다고 지적한 많은 사례가 있다는 점도 인식해야 합니다. 명백한 이유로 이러한 예는 거의 발표되지 않습니다.
모든 공급업체는 그들만의 특수 용어가 있고 장비와 사양을 나타내는 방식이 다양합니다. 그러나 단백질의 안정성을 측정하는 데 사용할 수 있는 장비에 대한 모든 고려사항은 특정 작업의 요구 사항과 제품 사양 및 기능이 이러한 요구 사항에 어떠한 영향을 미치는지를 이해하는 데서부터 시작됩니다.
단백질 안정성을 열량측정법 기술 외의 기술로 측정하는 대부분의 공급업체는 DSC와 비교해 해당 제품을 직접적으로 포지셔닝합니다. 이러한 제품 중 일부는 실행당 샘플 소비가 낮다는 특정한 이점이 있지만 정보 컨텐츠와 재현성이 부족합니다. 생성된 데이터가 결과를 오도하고 잘못된 의사 결정으로 이어진다면 샘플을 절약하는 것이 이점이 되지 않습니다. 모호한 단백질 안정성 데이터 때문에 개발 프로젝트의 큰 부분을 반복하는 것은 아주 높은 비용을 유발합니다.
1.장비를 사용하여 모든 단백질/바이오 치료 후보 물질의 안정성을 평가하기를 원하는가?
DSC는 트립토판 잔류물의 수나 위치에 관계 없이 모든 단백질 분석에 적용할 수 있습니다.
고유 형광을 측정하는 다른 기술은 단백질 안정성을 간접적으로만 분석할 수 있습니다. 이러한 기술이 측정하는 것은 단백질 풀림에 따른 트립토판 잔류물 환경의 극성 변화입니다.
이러한 접근법에는 여러 가지 문제가 있습니다. 이 특정 아미노산 잔류물의 환경 변화는 전체 분자 풀림을 대표할 수 있어야 합니다. 즉, 트립토판 잔류물이 단백질 핵심에 묻혀 있어야 할 뿐만 아니라 여러 영역 단백질의 모든 영역에서 나타나야 합니다. 그러나 현실에서는 그렇지 않습니다. 트립토판 잔류물에 포함되지 않는 하위 영역의 구조적 안정성은 평가되지 않기 때문에 잘못된 포뮬레이션 또는 후보 물질 선정으로 귀결될 수 있으며 이는 개발 파이프라인의 다음 부서에 영향을 미치게 됩니다. 일부 단백질의 경우에는 트립토판 잔류물 자체가 없어 고유 형광측정법을 사용해서는 전혀 분석할 수가 없습니다.
그림 1: 생물학적 후보 물질에 대한 DSC 서모그램. 이 데이터는 여러 완충액에서 항체의 열적 풀림을 보여주고 있습니다. 프로필에서 관찰되는 뚜렷한 숄더는 항체의 CH2, CH3, Fab 영역 풀림을 나타냅니다. 아래쪽 패널에 사용된 포뮬레이션 조건은 높은 TM과 낮은 T1/2 때문에 선택되었습니다.
2.여러 영역 단백질에서 모든 개별 영역의 안정성을 분석하고자 하는가?
DSC는 재현성이 높고 전체 단백질의 구조적 변화를 모니터링할 수 있기 때문에 개별적인 하위 영역의 안정성을 명확히 측정할 수 있습니다. 하위 영역에 대한 정보를 포함한 단백질 안정성 프로필을 작성하는 분광법 기술의 사례가 있지만 이 기술이 이러한 데이터를 제공하지 못하며 특정한 구조 변화를 감지하지 못한다는 사례 역시 많습니다. 이는 트립토판 잔류물이 형광 검출에 이상적인 방식으로 단백질 전체에 분산되어 있지 않거나, 일부 영역은 트립토판 잔류물이 묻혀 있고 일부는 그렇지 않기 때문입니다. 측정하는 데 사용된 기법으로는 볼 수 없는 단백질의 구조적 변화 때문에 장비가 첫 번째 전이를 감지할 수 없어 후보 물질이나 포뮬레이션 완충액을 잘못 선택하게 되는 경우 이러한 점이 특히 중요할 수 있습니다. DSC는 단백질 안정성을 측정하기 위한 총체적이고 포괄적인 고분해능 기법으로서 이러한 유형의 문제가 발생하지 않습니다.
그림 2: 고유 형광 감지에 의해 관찰된 항체의 열적 풀림. 이 프로필에는 급격한 전이가 없으며, 따라서 TM 측정을 위한 차선책임
항체의 하위 영역 안정성을 DSC로 측정하여 얻을 수 있는 다른 이점은 Fab 결합 영역의 크기가 일반적으로 CH2 및 CH3 영역보다 커서 식별하기가 쉽다는 것입니다. 대부분의 분광법 기법의 신호 진폭은 영역에 특이적이지 않습니다. 따라서 어떠한 영역이 안정화되었는지 아니면 불안정화되었는지 이해하기가 쉽지 않습니다. 이러한 점은 어떠한 생물학적 부분이 영향을 받는지 이해하는 것이 필수적인 단백질 엔지니어링 프로젝트와 후보 물질 선정에 있어 특히 중요합니다.
3.결과에 영향을 미칠 수 있는 실험 아티팩트(Artifact)가 없는 데이터가 필요한가?
샘플 소비량이 낮은 많은 방법들은 단백질 안정성에 대한 간접적 측정법으로서 형광측정법을 사용합니다. 앞서 설명한 문제와 함께 형광측정법은 특히, 일반적으로 샘플 농도의 작용에 따라 변화하는 급냉, 내부 필터링, 응집 및 광산란과 같은 특정한 아티팩트가 발생합니다. 이는 두 가지 중요한 결과를 가져옵니다. 첫째, 서로 다른 날짜에 데이터를 비교할 때 모든 공존 용질이 동일한 농도를 가지기 어렵고 시간이 크게 소모되기 때문에 재현 가능한 데이터를 얻기가 아주 어렵습니다. 둘째, 이러한 아티팩트는 풀림 곡선의 경사에 영향을 미쳐 실행 간에 분석 결과가 달라지고 매우 큰 주관성이 개입되기 때문에 정확한 해석을 위해 많은 양의 전문지식이 필요합니다.
일부 분광법 단백질 안정성 분석은 단백질 안정성을 모니터링하기 위해 염료를 사용해야 합니다. 이러한 분석법은 고유 형광측정법과 동일한 문제가 발생할 뿐만 아니라 염료가 단백질 안정성 자체에 영향을 미치거나 완충액 성분이 염료와 단백질의 상호 작용 범위에 영향을 미칠 수 있습니다. 또한 이로 인해 염료와 단백질의 상호작용이 반영되거나 단백질 안정성 자체에는 거의 영향을 미치지 않는 완충액 성분이 간섭을 일으켜 더욱 복잡하게 얽힌 안정성 프로필 결과가 도출될 수 있습니다. 잠정 약물 대상에 대한 저분자 결합의 선별을 위해 안정성 프로필을 간접적인 방법으로 사용하는 작업의 경우도 마찬가지 입니다.
DSC는 위에서 설명한 제한 사항이 적용되지 않기 때문에 전체 단백질의 안정성을 측정하는 최고의 기법이자 진정한 포괄적 기법이라 할 수 있습니다.
4.재현 가능한 데이터를 원하는가?
DSC는 데이터의 재현성이 높아 종종 단백질 안정성 분석에 있어 ‘절대적 표준’으로 언급되고 있습니다. 이러한 이유로 DSC는 생물학적 동등성 연구에 이용되고 있습니다. DSC는 최근 성공적이었던 바이오 치료제 Remsima(Remicade의 바이오 시밀러)의 승인 신청에 활용된 핵심 기술이었습니다. 다른 예로는 Amgen의 한 그룹이 수행했던 작업으로, 이들은 DSC가 산화된 바이오 치료 제품을 식별하는 데 있어 최고의 기법임을 발견했습니다. 이러한 응용의 성공 이면에는 DSC 데이터의 높은 재현성과 함께, DSC가 여러 영역 단백질의 고차원 구조에서 미묘한 변화까지도 감지할 수 있다는 점이 작용하였습니다.
또한 다양한 형태의 암을 가진 환자를 식별하는 진단 도구로서 DSC의 활용성이 연구되고 있습니다. 분명한 점은 DSC의 재현성이 이러한 응용에 있어 핵심이라는 것입니다. 다음은 이 작업을 수행했던 팀의 책임 연구원의 말을 인용한 것입니다. 그는 Malvern MicroCal VP-Capillary DSC를 통해 얻은 DSC 데이터의 높은 재현성을 강조하고 있습니다.
“대량의 샘플을 자동으로 처리하여 사람으로 인한 실수와 우발적 실수를 최소화하는 데 특히 유효했습니다.”
“놀라운 검사 재현성과 샘플 사용량을 줄여주는 인상적인 감도가 특징이었습니다."
“제어 소프트웨어로 직접 프로그래밍할 수 있었습니다."
“주기적인 세척/제어 스캔을 프로그래밍하여 쉽게 유지관리하고 상태를 유지할 수 있습니다.”
Adrian Velazquez-Campoy - Institute BIFI - 스페인 사로고사대학
5.광범위한 완충액 또는 공존 용질에서 생물 제제의 안정성을 측정하고자 하는가?
일부 기술은 호환 가능한 완충액과 공존 용질에 대해 아주 세세한 요구 사항이 있습니다. 원이색법은 이러한 제한의 좋은 예시입니다. 이 기법에서는 포뮬레이션 연구에 사용되는 것과 같은 특정 완충액이 단백질과 동일한 파장의 빛을 흡수하여 신호의 포화를 일으키기 때문입니다. 이와 함께 일반적인 포뮬레이션 완충액 성분인 세제를 아주 조금만 사용해도 대부분의 형광 기반 기술과 호환되지 않습니다.
DSC는 분광학 기법이 아니며 이러한 문제에 영향을 받지 않습니다.
6.열적 안정성이 높은 단백질을 분석해야 하는가?
DSC는 넓은 범위에서 단백질의 열적 안정성을 수용하고 측정할 수 있도록 특별히 고안되었으며 주변 온도 미만이나 고온에서도 작동하도록 설계되었습니다. 이와 달리 분광학 기법은 일반적으로 20°C 미만이나 90°C 초과 시에는 사용할 수 없습니다. 열적으로 불안정한 단백질의 열 변성은 주변 온도 미만에서 발생하기 시작하는 경우가 빈번하기 때문에 분광학 기법은 이를 놓치기 쉽습니다. 많은 단백질이 90°C 미만의 열 전이 TM(중간점)를 갖지만 스펙트럼의 다른 끝에서는 끝점을 정확히 측정할 수 있도록 20°C 이상의 온도가 필요합니다.
이는 단백질 중 하나의 TM이 70°C 미만일 경우 DSC를 사용해야 한다는 것을 의미합니다.
7.분석이 간편한 데이터를 원하는가?
Malvern MicroCal VP-Capillary DSC는 자동 분석 소프트웨어를 사용하여 주관성을 배제하고 전문지식의 필요성을 최소화하였습니다. 여러 경쟁 기술의 결과는 주관성이 아주 높거나 분석하기 어려울 수 있습니다. 이러한 점은 특히 항체와 같은 여러 영역 단백질을 분석할 때 명백히 드러납니다.
“사용하기 쉬운 분석 소프트웨어가 높은 처리량을 지원하기 때문에 더 이상 수동 계산이 필요하지 않아 시간이 절약됩니다. 이러한 시간 절약은 실제로 작업 흐름을 개선해주었습니다”
Katherine Bowers - Fujifilm Diosynth Biotechnologies
8.단백질 안정성의 미묘한 변화를 감지하고자 하는가?
DSC는 모든 수준의 단백질 구조(1차, 2차, 3차, 4차)에서 변화를 감지할 뿐 아니라 재현성이 매우 높습니다. 이는 DSC가 TM과 고차원 구조(HOS)의 아주 작은 변화도 감지한다는 것을 의미합니다.
최근의 사례는 여러 영역 단백질의 DSC 서모그램이 다양한 분광학 기술과 비교했을 때 원치 않는 저농도(<5 %)의 산화 바이오 치료제를 검출하는 데 있어 최고의 접근법임을 보여주었습니다(Arthur 외, (2015) J Pharm Sci, Vol 104, 1548–1554).
9.제조업체 또는 공급업체가 얼마나 우수한가?
우수한 품질의 장비에 투자하려면 이용하는 제조업체 또는 공급업체의 명성을 평가하는 것이 중요합니다.
DSC 장비는 정확하고 면밀한 결과를 얻기 위해 높은 기준을 적용해 제조하고 굳건한 기술 선도 기업에서 엔지니어링해야 합니다.
이러한 기술을 개발하고 최적화는 데 앞장 선 적절한 역사가 있는 제조업체를 선택하는 것이 좋습니다. 이러한 기업은 기계 간에 다양성이 뛰어난 장비들을 생산하며, 대개 기술과 응용에 있어 혁신적인 진보를 최초로 일궈냅니다. 이들은 전문지식과 경험을 갖추고 있을 가능성이 훨씬 높고 우수한 장비를 제작하는 것은 물론 이를 적절히 뒷받침하는 자원을 지원합니다.
10.판매후 서비스 지원은 어떠한가?
장비 구매는 공급업체/제공업체와의 장기적 관계의 시작에 불과하므로 만족스러운 서비스와 판매후 지원을 제공하는 회사의 시스템을 구매하는 것이 중요합니다.
전화/파견/이메일 지원, 지속적인 교육 기회, 현장 서비스 및 전문가 수준의 지원을 제공하는 회사를 선택하는 것이 좋습니다. 장비를 구매하기 전에 어떠한 지원이 제공되는지 문의하여 실험실에 새 장비를 설치했을 때 기대되는 지원의 품질과 깊이를 이해하는 것이 중요합니다.
응용/요구 사항 | MicroCal DSC | 원이색법 | 고유형광측정법 | 외부형광측정법 |
모든 단백질에 포괄적으로 적용 가능 | 예 | 예 | 아니요 | 아니요 |
모든 수준의 단백질 구조 감지 | 예 | 아니요 | 아니요 | 아니요 |
정량적 판독값이 접힌 물질의 양과 정비례 | 예 | 예 | 아니요 | 아니요 |
포괄적인 고분해능 단백질 안정성 분석법 | 예 | 아니요 | 아니요 | 아니요 |
다양한 단백질 안정성 측정지표 | 예 | 아니요 | 아니요 | 아니요 |
풀림 프로필 속성에 대한 지문 분석 | 예 | 아니요 | 아니요 | 아니요 |
광학적 아티팩트 부재 | 예 | 아니요 | 아니요 | 아니요 |
높은 재현성 | 예 | 아니요 | 아니요 | 아니요 |
염료, 표지 또는 화학 첨가제 불필요 | 예 | 예 | 예 | 아니요 |
완충액 및 공존 용질의 간섭이 없음 | 예 | 아니요 | 아니요 | 아니요 |
70°C 이상의 TM 측정 | 예 | 아니요 | 아니요 | 아니요 |
절대적 표준의 TM 측정치 | 예 | 아니요 | 아니요 | 아니요 |
위의 표는 DSC가 바이오 제약 산업 전반에서 널리 사용되고 있고 단백질 안정성 측정을 위한 “절대적 표준”으로 평가되는 이유를 명확히 보여주고 있습니다. 이러한 주장은 다수의 업계 전문가에게 바이오 제약 개발 파이프라인의 주요 작업에 대한 기술의 활용도에 대해 순위를 묻고 수집한 응답에 대해 상세히 기술한 최근 논문을 통해 뒷받침되고 있습니다(Gabrielson and Weiss IV (2015), Journal of Pharmaceutical Sciences 104:1240–1245). 응용 분야는 후보 물질 선정 및 포뮬레이션 개발에서부터 생물학적 동등성에 이르기까지 다양합니다.
DSC는 분명히 바이오 제제의 안정성을 평가하는 데 있어 가장 보편적으로 적합한 기술입니다.
일부 비분광학 기법은 DSC보다 샘플 소모량이 낮지만 염료 간섭, 산란, 내부 필터링, 신호 부족/결핍, 부실하게 정의된 하위 영역 구조 정보와 같은 고유의 약점으로 인해 이러한 작업에 적합하지 않은 경우가 많습니다.
이러한 많은 결점과 비호환성은 비용을 크게 증가시키고 최선의 의사결정에 이르지 못하게 함으로써 재개발 프로젝트를 수행해야 하거나 바이오 약물의 개발 가능성이 없는 것으로 확인되는 결과를 낳습니다.
Malvern MicroCal DSC는 모든 완충액의 모든 단백질에 대해 재현 가능하고 아티팩트가 없는 절대적 표준의 안정성 데이터를 제공합니다.
