등온 적정 열량측정계 구매 시 고려해야 할 10가지 주요 요인

소개

등온 적정 열량측정계(ITC) 기기의 물리적 구성 요소 및 기능과 기술 사양은 새 시스템을 구입할 때 반드시 고려해야 할 사항입니다. 그러나 문서상의 사양은 혼란과 오해의 소지가 있으며 실제로는 기기의 실제 성능과 거의 관련이 없을 수 있습니다. 문서상의 사양은 샘플에 대한 측정을 수행할 때 반드시 장점 또는 단점으로 작용하지는 않습니다. 샘플 작업 시 데이터 품질이 실질적으로 개선되고 사용 편의성이 향상되는 방식으로 기기를 조립하거나 최적화하지 않았다면 세계 최고의 부품과 기술 사양을 갖추는 것만이 능사는 아닙니다.

등온 적정 열량측정계 평가를 시작할 때 자문해야 할 몇 가지 질문이 있습니다.

이해해야 하는 기기 간의 주요 차이점은 무엇인가?

공급업체마다 자체 전문 용어를 사용하며 사양과 기기를 소개하는 방법도 다릅니다. 그러나 ITC 기기에 대한 모든 고려 사항은 응용 분야 요구 사항과 사양 및 기능이 어떻게 영향을 미치는지 이해하는 것부터 시작해야 합니다.

1. 샘플 소비가 중요한가?

기기의 감도를 평가하는 일반적인 방법은 노이즈 사양을 비교하는 것입니다. 합리적인 방법으로 보일 수 있지만 이러한 값은 공급업체별로 노이즈를 다르게 정의하기 때문에 비교하기가 어렵습니다. 유의해야 할 중요한 관련된 요소는 다음과 같습니다.

1/ 일반적인 주입 시간 동안의 기준선 가변성

2/ 주입 피크 면적의 측정 정확도

양호한 ITC 결합 곡선은 일련의 주입 가열로 구성되며 이러한 피크의 영역을 측정할 수 있는 정확도는 K_D 및 기타 매개변수의 값에 직접 영향을 미칩니다(도표 1 참조).

도표 1: ITC 주입 피크 비교. 왼쪽의 피크 면적은 피크의 시작점과 끝점 사이에 기준선을 그릴 수 있으므로 측정하기가 쉽습니다. 오른쪽의 피크 면적은 피크의 시작점과 끝점을 식별하기 어려우므로 확실히 측정하기가 어렵습니다.

이는 샘플 소비를 최소화하는 것이 중요하거나 밀접한 상호 작용의 친화도를 측정할 경우 낮은 샘플 농도에서 작업할 때 특히 두드러집니다. (도표 2 참조)

도표 2: 양호한 ITC 등온선과 불량한 ITC 등온선. 피크 면적을 정확하게 측정할 수 있으면 실험 데이터 포인트가 피팅된 결합 등온선에 잘 피팅될 가능성이 훨씬 높습니다. 왼쪽의 데이터를 얻기 위해 사용된 데이터의 실험 피크는 오른쪽의 데이터보다 식별하기 쉬웠습니다. 오른쪽의 데이터는 산란되어 있지만 친화도 및 기타 열역학 데이터를 생성할 수는 있습니다. 그러나 데이터가 얼마나 정확할지는 확실하지 않습니다.

일부 공급업체의 기준선 가변성(도표 3 참조)은 정상으로 보일 수 있지만 분석 프로세스 전에 원시 데이터가 주관적인 조작을 거친 경우가 많습니다.

도표 3: 단기 노이즈 및 드리프트의 예 왼쪽 도표의 녹색 선은 단기 노이즈의 두 가지 예를 보여줍니다. 데이터 세트가 높을수록 노이즈가 높습니다. 그러나 일반적인 ITC 데이터의 피크 면적을 측정하는 데는 두 가지 방법 중 어느 쪽을 사용해도 무방합니다. 그러나 검은색 선은 단기 노이즈(몇 초 이상)가 크지만, ITC 피크의 너비인 2~3분 범위에서 매우 가변성이 크며 피크 면적 데이터를 정확하게 측정하는 데 가장 큰 영향을 미칩니다. 오른쪽 그림은 드리프트가 있는 데이터를 보여줍니다. 드리프트는 미관상으로 매끄러워 보이지는 않지만 피크 면적을 정확하게 측정하는 데 영향을 미치지 않으면 피팅된 매개변수의 품질에 영향을 미치지 않고 수용할 수 있습니다.

이것은 시간이 많이 소요되는 프로세스일 뿐만 아니라 무엇보다도 K_D 데이터 및 기타 매개변수의 불확실성을 높입니다. ITC 기기를 비교할 때 피크 면적 측정의 정확성을 확실하게 테스트할 수 있도록 낮은 농도에서 측정하는 것이 좋습니다. 이상적으로 이 프로세스는 가장 까다로운 경우를 제외하면 항상 자동으로 수행되어야 합니다. 먼저 이 절차를 직접 수행하여 프로세스를 완전히 파악하는 것이 중요합니다. 절차의 견고성은 반복 실험에서 생성된 친화도와 기타 열역학적 매개변수를 비교하여 평가해야 합니다.

2. 반복 가능한 데이터가 중요한가?

높은 농도에서 측정을 수행해도 반복 가능한 데이터를 얻는 데 기여할 수 있는 요인은 여러 가지가 있습니다. 한 가지 요인은 주사기 세척입니다. 실험 사이에는 주사기를 건조하는 것이 좋습니다. 주사기를 건조하지 않고도 리간드 재료를 세척에 사용되는 물이나 완충액으로 쉽게 희석할 수 있습니다. 주사기에 물이 2µl만 남아 있더라도 리간드가 5% 희석되며, 이 오차는 측정된 상호 작용의 엔탈피에 동일한 양만큼 직접적으로 영향을 미칩니다. 주사기를 메탄올로 쉽게 헹군 후 건조할 수 있는 열량측정계가 있는지 확인하십시오.

또 다른 요인은 주입 반복성입니다. 열량측정계에는 높은 반복성으로 매우 적은 양을 제공할 수 있는 정밀 피펫이 있어야 합니다.

도표 4: 20mM NaOH로 적정되는 일련의 2mM 호박산 주입. 피펫의 주입 열 반복성을 측정하기 위해 7개의 다른 주입량으로 6개의 주입 세트를 만들었습니다. 1.5µl 주입의 주입 반복성은 1.5%보다 우수했습니다.

3. 기기와 소프트웨어가 얼마나 사용자 친화적인가?

소프트웨어와 하드웨어의 사용자 인터페이스를 모두 평가해야 합니다. 이상적으로는 주사기 충전과 건조가 모두 빠르고 쉬워야 합니다. 셀 포트는 열량 측정 셀에 샘플을 쉽게 충전하고 실험에 기포가 유입되지 않도록 쉽게 볼 수 있어야 합니다.

소프트웨어의 사용 편의성 역시 중요합니다. 사용자 친화성은 사용자에 따라 다르므로 실험 환경에 가장 중요한 기능을 확인하십시오. 가장 좋은 방법은 기기를 실행하고 데이터 분석을 직접 수행해 보는 것입니다. 샘플을 공급업체의 실험실로 보내고 나중에 포스트에서 보고서를 받는다고 해서 기기 작동, 샘플 테스트 또는 데이터 분석 방법을 이해하는 데에는 도움이 되지 않습니다. 소프트웨어를 사용하고 한두 가지 실험을 처음부터 끝까지 진행해 보십시오. 이렇게 하면 기기와 소프트웨어가 얼마나 사용자 친화적인지에 충분히 파악할 수 있으므로 많은 도움이 됩니다.

4. 하루에 진행할 수 있는 실험 수를 최대화하려 하는가?

기기의 반응 시간은 샘플 소비량과 실험을 진행하는 데 걸리는 시간 모두에 영향을 줄 수 있습니다. 반응 시간은 제조업체마다 다른 방식으로 계산할 수 있지만, 실험을 진행하고 설정하는 데 걸리는 시간을 비교하여 기기의 반응 시간을 간단하게 비교할 수 있습니다. 반응 시간이 빠를수록 하루에 더 많은 실험을 진행할 수 있으며 샘플 요구 사항이 적은 경우가 많습니다.

실험실에서 양호한 열량 측정 데이터의 필요성이 증가할 것으로 예상되는 경우 자동화 기기를 제공하는 공급업체와 기기를 자동 플랫폼으로 업그레이드할 수 있는지 여부를 고려해야 합니다.

5. 광범위한 친화도를 측정할 수 있어야 하는가?

ITC에서 밀접한 상호 작용의 친화도를 측정하려면 낮은 샘플 농도를 사용해야 합니다. 따라서 이러한 실험은 가장 까다로운 실험이며 기기로 적은 열을 정확하게 측정할 수 있어야 합니다. 이를 수행할 수 있는 기기의 능력은 여러 가지 요인에 따라 달라지며, 그중 일부는 이 가이드에 이미 언급되어 있습니다(예: 기준 가변성 및 반응 시간). 또한 측정하려는 결합 과정의 내재된 열에 따라서도 달라집니다. 긴밀한 상호 작용을 측정하기 위한 기기의 적합성을 확인할 때에는 몇 가지 사항을 확인해야 합니다. 첫 번째는 낮은 농도의 샘플을 사용하고 반복 실험에서 파생된 친화도의 가변성을 살펴보는 것입니다. 두 번째는 문헌을 확인하는 것입니다. 이러한 상호 작용의 우수한 반복성을 보여 주는 발표된 데이터를 찾아야 하며, 숫자가 포함된 표가 아닌 바인딩 등온선 자체를 제시하는 문헌이 좋습니다. 좋은 문헌의 예로는 Lulf et al. 2014(1.6nM)¹ 및 Ramakrishnan et al. 2012(2.5nM)²이 있습니다.

약한 상호 작용을 측정하려면 더 높은 농도에서 작업해야 합니다. 이러한 경우에는 충전 오류를 최소화하고 측정을 다시 진행할 필요성을 최소화하기 위해 충전이 쉬운 기기를 찾아야 합니다.

6. 광범위한 응용 분야를 수용할 수 있어야 하는가?

특정 응용 분야에 대한 기기의 기능을 확인해야 합니다. 예를 들어 금은 열 측정에 적합한 열 특성이 있습니다. 그러나 단백질과 이황화물의 상호작용을 측정하려면 티올기와 상호작용하지 않는 셀이 있는 열량측정계를 선택해야 합니다. 티올, 이황화물, 티오에테르가 금과 강력하게 상호작용을 한다는 사실은 문헌에 잘 정립되어 있습니다³. 강한 황-금 상호 작용은 조밀하게 포장된 자체 조립 모노레이어 형성을 촉진합니다⁴. 이러한 결합은 결과에 영향을 줄 수 있습니다. 또한 금과의 상호작용이 강하므로 셀이 단백질로 코팅되고 후속 실험을 오염시키는 것을 방지하려면 철저하게 세척해야 합니다.

7. 결과를 얼마나 신뢰할 수 있는가?

데이터에 대한 신뢰도는 반복 실험을 수행함으로써 얻을 수 있습니다. 그러나 샘플이 제한적일 때는 과학계에서 널리 사용되고 있고 광범위한 응용 분야에서 고품질 데이터를 생성해 온 오랜 역사를 가진 기기를 사용하면 안심할 수 있습니다. 이를 확인하려면 문헌을 참조하여 자신이 소속한 분야의 영향력 있는 연구진이 사용해 온 기기를 확인하십시오.

8. 제조업체 또는 공급업체가 얼마나 우수한가?

사용하는 제조업체 또는 공급업체의 평판을 평가하는 것이 중요합니다. ITC 기기는 정확하고 면밀한 결과를 얻기 위해 높은 기준을 적용해 제조하고 굳건한 기술 선도 기업에서 엔지니어링해야 합니다.

이러한 기기를 개발하고 최적화하는 데 앞장선 적절한 역사가 있는 제조업체를 찾는 것이 좋습니다. 이러한 기업은 기기 간에 변동성이 거의 없는 기기를 생산하며, 대개 기술과 응용에 있어 혁신적인 진보를 최초로 일궈냅니다. 이러한 회사는 오랜 기간 학습 곡선을 거쳐 왔으므로 크게 도움이 될 것입니다. 이러한 회사는 전문 지식과 경험을 갖추고 있을 가능성이 훨씬 높고 우수한 장비를 제작하는 것은 물론 이를 적절히 뒷받침하는 자원을 지원합니다.

9. 판매 후 서비스 지원은 어떠한가?

기기를 구입하는 것은 사용자 경험의 시작에 불과하므로 세계적인 수준의 서비스와 판매 후 지원을 제공하는 회사에서 시스템을 구입하는 것이 중요합니다.

전화/파견/이메일 지원, 지속적인 교육 기회, 현장 서비스 및 전문가 수준의 지원을 제공하는 회사를 찾는 것이 좋습니다. 기기를 구입하기 전에 어떤 지원이 제공되는지 문의하십시오. 구매 결정을 내리기 전에 새로운 기기를 실험실에 설치할 경우 기대할 수 있는 지원의 품질과 깊이를 파악할 수 있도록 이러한 지원 중 일부를 제공해 달라고 요청할 수 있습니다.

10. 문서상 사양이 같다면 가격이 가장 낮은 기기를 구매하는 것이 좋은가?

절대로 그렇지 않습니다.

ITC 기기는 설계, 품질 및 성능에서 크게 차이가 있을 수 있습니다.

문서상으로는 서로 다른 기기라도 사양이 유사해 보일 수 있지만 실제 성능, 품질 및 수명은 크게 다릅니다. 인생에서 많은 일들이 그렇듯이 가장 저렴한 옵션은 장기적으로는 최선의 가치를 제공하지 못하는 경우가 많으며 보통 장기적으로 더 큰 비용을 초래합니다. 속도가 느리고 반복성이 떨어지는 장비는 추가 샘플과 데이터 생성에 필요한 시간 측면에서 큰 비용이 발생하게 됩니다.

참고 문헌

1. Lulf et al. Structural basis for the inhibition of HIV-1 Nef by a high-affinity binding single-domain antibody Retrovirology 2014, 11:24 
2. Ramakrishnan et al. Probing Cocaine-Antibody Interactions in Buffer and Human Serum. PLoS ONE. 2012. V. 7(7). e40518 
3. Ulman, A. Introduction to Ultrathin Films; From Langmuir-Blodgett Films to Self-Assembly; Academic Press: Boston, 1991. 
4. Dubois,L. H.; Nuzzo, R. G. Annu. ReV. Phys. Chem. 1992, 43, 437-463.