통찰력의 발견: NanoSight Pro를 통한 세포외 소포 형광 라벨링 및 분석 마스터링

이 백서에서는 NanoSight Pro를 통한 형광 라벨링 및 세포외 소포(EV) 검출을 위해 개발된 방법과 이러한 방법의 실행을 안내할 대표성 있는 데이터를 제시합니다. 

소변에서 확보한 EV를 사용하여 광산란과 형광 분석을 통해 크기 분포 및 농도를 평가합니다. 다양한 형광 염료 및 형광단 배열을 이용하여 EV의 존재를 확인했을 뿐만 아니라, 표면 및 내부 RNA 운반 물질에서 테트라스파닌 바이오마커를 효과적으로 검출했습니다.

1.0 소개

세포외 소포(EV)에 대한 지속적인 탐구는 그 활용과 혁신적인 성과가 점차 확장됨에 따라 더 큰 관심을 불러일으키고 있으며, 특히 질병 진단과 치료 분야의 잠재력이 두드러지고 있습니다[1]. 살아있는 유기체 내 세포에 의해 생성된 이 미세 생물학 물질은 처음에는 세포의 폐기물로 여겨졌습니다. 그러나 연구를 통해 이러한 물질이 세포 간의 통신에서 중요한 역할을 한다는 것이 밝혀졌습니다. 

세포외 소포는 포괄적인 용어로, 다양한 EV 하위 유형 정의가 사용됩니다. 크기 범위에 따른 분류도 있는데, 작은 EV(<200nm)와 큰 EV(>200nm)로 구분됩니다. 엑소좀은 작은 EV의 한 하위 유형으로, 플라즈마 막에서 기원한 EV와 관련이 있습니다 [2]. 

체액에서 추출된 세포외 소낭은 비EV 구성 요소와 함께 매우 다양한 이종 시스템을 생성하며, 이로 인해 분석적 특성 분석에 상당한 어려움이 발생합니다 [2]. 중요 EV 특성에는 크기와 크기 분포가 포함되며, 이는 기원과 정제 방법 유효성을 파악하는 데 유익할 수 있습니다. 방출된 EV 농도 변화는 세포 간 통신이 증가했음을 나타낼 수 있으며, 이는 진단 잠재력을 가지고 있습니다[5]. EV 제제의 크기, 불균질성, 농도를 정확하게 분석하면 프로파일링, 생물학적 기능 이해 및 진단 조건에 필요한 필수 정보를 얻을 수 있습니다. 

EV에는 단백질, 지질, 핵산(RNA 및 DNA 포함)과 같은 다양한 분자가 포함되어 있습니다. 운반 물질 분자를 포함한 EV의 조성은 해당 기원 세포의 생리학적 또는 병리학적 상태를 반영할 수 있습니다. 이러한 특성으로 인해 EV는 암과 신경퇴행성 질환, 염증 상태에 이르기까지 광범위한 질환에 대해 유망한 바이오마커로 주목받고 있습니다. [4]. 현재까지 EV 또는 EV 하위 유형 [2]에 대해 허용되는 범용 분자 마커는 없습니다. 모든 EV에서 공통적으로 발견되지는 않지만 연구에서 널리 사용되는 대표적인 바이오마커는 테트라스파닌(CD9, CD81, CD63 등)입니다. 이들은 세포 용해물과 달리 작은 EV의 표면에 축적됩니다 [5]. 테트라스파닌은 막관통 단백질로서 즉 생성, 전달 물질 분류, 수용 세포와의 상호작용 등 EV 생물학의 다양한 측면에 깊이 관여합니다. 많은 EV 하위 집합의 표면에서 풍부하게 존재하기 때문에 연구에서 가장 접근하기 쉬운 바이오마커로 간주되며, EV 프로파일링에서 엑소좀 마커로 자주 활용됩니다. 따라서 이러한 바이오마커를 검출할 수 있는 능력은 EV 조사에서 상당히 중요합니다[6].

또한, EV 내에서 RNA를 검출하고 정량화하는 능력은 치료 응용을 위한 캡슐화의 성공 및 진단 가능성에 대한 귀중한 통찰력을 제공하기 때문에 마찬가지로 중요합니다. RNA 운반 물질 분석은 EV의 세포 간 통신 및 질병 과정에서의 기능적 역할을 밝히는 데 도움을 줄 수 있으며, 동시에 표준화와 품질 관리에도 활용될 수 있습니다 [7].

2.0 NanoSight NTA

EV는 그 특성이 복잡하기 때문에 완전한 특성 분석을 위해 종종 여러 기술을 결합한 접근법이 적용됩니다. 여기에는 유세포분석, 웨스턴 블롯, 효소결합면역흡착측정법(ELISA), 질량분석 기반 단백질체학, 현미경 기반 방법, 나노입자 추적 분석(NTA) 등이 포함됩니다 [8], [9], [2]. NTA는 세포외 소포의 고분해능 크기 및 농도를 신속하게 특성화하는 데 일반적으로 사용되는 기법으로 자리잡았습니다 [10].

그림 1: NTA 광학 설정 구성도 

NanoSight NTA는 레이저를 사용하여 입자를 조사하고 광학 현미경 구성을 사용하여 입자에서 발생하는 광 산란을 캡처합니다. 브라운 운동을 추적하고 Stokes-Einstein 방정식을 적용하면 NanoSight로 입자의 유체역학적 지름을 측정할 수 있습니다. 농도는 입자 수를 기반으로 도출합니다. NanoSight Pro에는 추가적인 형광 분석 기능이 있어, 특정 레이저 여기가 방출된 형광 파장이 일치하는 장파역 광학 필터를 통해 검출기에 도달하도록 유도합니다. 또한 광표백 효과를 줄이기 위해 레이저를 간헐적으로 비활성화하고 측정 간에 새로운 샘플을 주입합니다. 이러한 새로운 기능은 입자 식별을 위한 학습된 신경망 [11] 및 측정 중 샘플을 지속적이고 제어된 방식으로 펌핑하는 기능과 결합되어 형광 검출의 품질을 향상하고 보장하는 데 필수적입니다.

형광 NTA는 샘플에 대한 보다 깊은 통찰력을 제공하며 하위 모집단을 구분할 수 있습니다. 이러한 기능은 EV 연구에서 점점 더 중요해지고 있으며, 정제 효율을 평가하고, 엑소좀 샘플에서 특정 마커 또는 운반 물질의 존재를 확인하는 데 사용됩니다 [12].

3.0 재료 및 방법

3.1 시약

이 연구에서는 HansaBioMed Life Sciences (Cat# HBM-PEU)에서 제공한 건강한 공여자의 소변에서 얻은 동결건조 엑소좀 형태의 EV를 사용합니다. 이 엑소좀은 이전에 웨스턴 블롯과 유세포분석으로 확인된 테트라스파닌 CD9, CD63, CD81을 발현합니다[13]. 

엑소좀은 막, 특정 바이오마커, RNA 라벨링을 통해 표지했습니다. 이 연구는 각 라벨링에 대한 최종 방법을 제시합니다. 

CellMask™ Orange Plasma Membrane Stain(Cat# C10045, Invitrogen™) 및 ExoGlow™-NTA Fluorescent Labeling Kit(Cat# EXONTA200A-1, System Biosciences)를 EV 막 라벨링에 사용했습니다. 

직접 항체 라벨링을 통한 바이오마커 검출을 위해 Alexa Fluor® 488 및 PE/Cyanine7 형광 항체를 사용하여 CD9, CD63 및 CD81 테트라스파닌을 라벨링했습니다. Alexa Fluor™ 488 anti-human CD9 Monoclonal Antibody (MEM-61) (Cat # MA5-44126), Alexa Fluor™ 488 anti-human CD81 Monoclonal Antibody (M38) (Cat # MA5-44132)는 Invitrogen™에서 구매했습니다. Alexa Fluor® 488 anti-human CD63 Antibody (Cat # 353037), PE/Cyanine7 anti-human CD9 Antibody (Cat # 312115), PE/Cyanine7 anti-human CD63 Antibody (Cat # 353009) and PE/Cyanine7 anti-human CD81 (TAPA-1) antibody (Cat # 349511) 염료는 Biolegend에서 구매했습니다. Quant-iTTM RiboGreen RNA 키트(RNA 시약 및 TE 완충액이 들어 있는 Cat# R11491)는 Invitrogen™에서 구매했으며 엑소좀 내 RNA 라벨링에 사용했습니다. 

모든 샘플은 인산염완충식염수(PBS), pH 7.4(1X)(Cat# 10010023, Gibco™) 또는 입자가 제거된 증류수(Milli-Q)로 준비했습니다. 

3.2 EV 준비

동결 건조된 엑소좀은 100µg 샘플에 100µl의 증류수(Milli-Q)를 첨가하고, 부드럽게 피펫팅하여 혼합함으로써 약 1 × 10¹² 입자/mL 농도의 엑소좀 스톡을 만들었습니다(그림 2). 

모든 샘플은 동일한 엑소좀 스톡을 사용하여 여러 날에 걸쳐 준비 및 측정했습니다. 모든 샘플 준비에 부피 희석을 사용했기 때문에 희석 과정에서 오류가 발생할 가능성이 있으며, 이로 인해 보고된 샘플 농도 값에 변동이 생길 수 있습니다.

그림 2: 소변에서 추출한 엑소좀의 재구성 과정을 보여주는 도식

3.2.1 대조군 엑소좀 

엑소좀 스톡은 여과된 인산완충식염수(PBS, 1X)을 사용하여 연속 희석하여 5000배 부피 희석하여 최종 농도가 NTA 측정에 적합한 약 2-5 × 10⁸ 입자/mL로 맞췄습니다(그림 3). 농도 변화가 발생한 이유는 희석이 부피 기반으로 수행되었고, 서로 다른 날에 진행되었기 때문입니다. 라벨링하지 않은 대조군은 라벨링한 각각의 샘플과 동일한 조건, 동일한 일시에 준비했습니다.

그림 3: 비형광 대조군으로 사용할 소변 추출 엑소좀을 NanoSight Pro 측정에 적합한 농도로 만들기 위한 부피 기반으로 3단계 연속 희석하는 과정의 도식.

3.2.2 막 라벨링 

구조에 지질 이중층이 포함된 EV는 지질막을 표지하기 위해 막 염료를 활용하기에 훌륭한 후보입니다. 일반 막을 사용하여 EV를 라벨링하는 것은 비교적 간단하며, 염료가 쉽게 침투하여 대량으로 지질 이중층에 통합되기 때문에 염색된 EV에서 방출되는 형광 신호는 일반적으로 매우 효과적입니다. [14]. 염료가 다른 혈장 성분이나 비EV 지질 성분에도 민감하기 때문에 막 라벨링은 특이적이지는 않지만, EV이 많이 포함된 정제된 샘플에서 EV의 존재를 확인하기 위한 일반적 설명의 첫 단계로 자주 활용됩니다. CellMask™ Orange(CMO)와 ExoGlow가™ 사용되었고 두 라벨링 프로토콜 모두 아래에서 확인할 수 있습니다.

3.2.2.1 CellMask™ Orange(CMO)를 이용한 막 라벨링

CellMask™ Orange(CMO) Plasma Membrane Stain은 5μg/ml 농도의 CMO 염료 스톡을 만들기 위해 연속 희석하여 PBS로 10,000배 희석했습니다(그림 4B). 엑소좀 스톡을 PBS로 10배 희석하여 엑소좀 작업용 스톡 A를 만들었습니다(그림 4A). 동일한 양(10μl)의 CMO 염료 스톡과 엑소좀 작업용 스톡 A를 Eppendorf 튜브에 추가했으며, 피펫팅하여 부드럽게 혼합하고 실온 상태의 어두운 곳에서 20분 동안 반응하도록 두었습니다(그림 4C). 그런 다음 엑소좀 염료 혼합물을 PBS로 500배 더 희석하여 NTA 측정에 적합한 최종 엑소좀 농도를 만들었습니다(그림 4D).

그림 4: CellMaskTM Orange(CMO)로 소변 라벨링에서의 엑소좀 단계를 보여주는 도식. A - 엑소좀 작업용 스톡 A 준비, B - CMO 스톡 준비, C - 라벨링 혼합물 준비 및 배양, D - CMO 라벨링된 엑소좀의 최종 희석.

3.2.2.2 ExoGlow™를 이용한 막 라벨링

ExoGlow™-NTA 형광 라벨링 염료를 PBS를 사용하여 10배 희석하여 ExoGlow™ 염료 스톡을 만들었습니다(그림 5B). 엑소좀 스톡을 PBS로 5배 희석하여 엑소좀 스톡 B를 만들었습니다(그림 5A). Eppendorf 튜브에 ExoGlow™ 염료 스톡과 엑소좀 작업용 스톡 B를 동일한 부피(10μl)로 추가하고 피펫팅하여 부드럽게 혼합하고 실온 상태의 어두운 곳에서 20분 동안 반응하도록 두었습니다(그림 5C). 그런 다음 엑소좀 염료 혼합물을 PBS로 1000배 더 희석하여 NTA 측정에 적합한 최종 엑소좀 농도를 만들었습니다(그림 5D).

그림 5: ExoGlow을 사용한 소변 라벨링 시 엑소좀의 단계를 보여주는 도식. A - 엑소좀 작업 스톡 B 준비, B - ExoGlowTM 스톡 준비, C - 라벨링 혼합물 준비 및 배양, D - ExoGlowTM 라벨링된 엑소좀의 최종 희석.

3.2.3 바이오마커 테트라스파닌 라벨링

CD9, CD63, CD81은 엑소좀 식별자로 사용되므로 이러한 테트라스파닌의 존재를 탐지하면 엑소좀 기원에 대한 정보를 얻을 수 있습니다. 이 연구에서 사용된 엑소좀은 제품 기사양에서 제조자가 확인한 CD9, CD63, CD81 마커가 있었습니다 [15]. 엑소좀 표면의 바이오마커를 표지하는 데 일차 항체 라벨링이 사용했습니다. 이 방법은 형광단과 결합된 항체를 사용하여 엑소좀 표면의 관심 항원을 직접 인식하고 결합할 수 있습니다. 두 가지 형광단(Alexa Fluor® 488 및 PE/Cyanine7)가 사용되었으며, 각각 항CD9, 항CD63, 항CD81의 테트라스파닌 마커에 대한 3가지 서로 다른 항체와 연결되었습니다. 두 형광단의 프로토콜은 아래에 나와 있습니다. 

3.2.3.1 Alexa Fluor® 488 항체를 이용한 테트라스파닌 라벨링

anti-human CD9 Alexa Fluor® 488 항체, anti-human CD63 Alexa Fluor® 488 항체, anti-human CD81 Alexa Fluor® 488 항체 염료는 처음에 PBS로 각각 50배 희석하여 세 가지 형광 항체 스톡을 만들었습니다(그림 6B1, 6B2, 6B3). 각 항체 염료 스톡에서 10μL를 채취하여 다른 Eppendorf 튜브에 추가했습니다. 동일한 양(10μl)의 엑소좀 작업용 스톡 B(섹션 3.2.2.2에 제시된 바와 같이 준비됨)(그림 6A)도 각 튜브에 추가했으며, 피펫팅하여 부드럽게 혼합하고 실온 상태의 어두운 곳에서 30분 동안 반응하도록 두었습니다(그림 6C1, 6C2, 6C3). 각 엑소좀-항체 염료 혼합물은 PBS로 500배 희석하여 NTA 측정에 적합한 최종 엑소좀 농도를 만들었습니다(그림 6D1, 6D2, 6D3).

3.2.3.2 PE/Cyanine7 항체를 이용한 테트라스파닌 라벨링

PE/Cyanine anti-human CD9 항체, PE/Cyanine anti-human CD63 항체, 그리고 PE/Cyanine anti-human CD81 항체는 처음에 PBS로 각각 10배, 10배, 40배 희석하여 세 가지 형광 항체 스톡을 만들었습니다(그림 6B1, 6B2, 6B3). 각 항체 염료 스톡에서 10μL를 채취하여 다른 Eppendorf 튜브에 추가했습니다. 동일한 양(10μl)의 엑소좀 작업용 스톡 B(섹션 3.2.2.2에 제시된 바와 같이 준비됨)(그림 6A)도 각 튜브에 추가했으며, 피펫팅하여 부드럽게 혼합하고 실온 상태의 어두운 곳에서 30분 동안 반응하도록 두었습니다(그림 6C1, 6C2, 6C3). 각 엑소좀-항체 염료 혼합물은 이후 PBS로 추가적으로 500배 희석하여, 섹션 3.2.3.1과 같이 NTA 측정에 적합한 최종 엑소좀 농도로 조정했습니다(그림 6D1, 6D2, 6D3). 

그림 6: 형광단(F*)이 결합된 1차 anti-human CD9, anti-human CD63, anti-human CD81 항체를 이용한 소변 유래 엑소좀 라벨링 단계를 보여주는 도식. F*는 형광단(fluorophore)을 의미합니다. A - 엑소좀 작업용 스톡 B 준비, B - F* 결합 anti-human(CD9, CD63, CD81) 항체 스톡 준비, C1-C3 - 라벨링 혼합물 준비 및 배양, D1-D3 - F* 결합 anti-human(CD9, CD63 및 CD81) 라벨링된 엑소좀의 최종 희석

3.2.3 RNA 라벨링 

엑소좀은 종종 RNA의 한 형태인 자신의 운반 물질과 세포 통신을 매개합니다. RNA는 엑소좀 내부에 포함되어 있기 때문에 엑소좀을 파괴하지 않고 이 성분을 특성 분석하는 것은 매우 어렵습니다. 이 백서에서는 EV 내부의 RNA 라벨링에 대한 새로운 접근법을 설명합니다. 용액 내 RNA 정량화를 위해 사용하는 RNA 특이적 염료인 Quant-iT™ RiboGreen을 선택했습니다. 여기서는 시약을 사용하여 준비한 소변 샘플에서 엑소좀의 RNA-EV를 검출합니다.

3.2.3.1 Quant-iT™ RiboGreen을 이용한 RNA 라벨링

Quant-iT™ RiboGreen을 20x TE 완충액(라벨 표시 키트에 포함)으로 25배로 희석하여 염료 스톡을 만들었습니다(그림 7B). 엑소좀 스톡을 PBS로 100배로 희석하여 엑소좀 작업용 스톡 C를 만들었습니다(그림 7A). Eppendorf 튜브에 염료 스톡과 엑소좀 작업용 스톡 C을 동일한 용량(20cl)으로 추가하고 피펫팅하여 부드럽게 혼합하고 실온 상태의 어두운 곳에서 30분 동안 반응하도록 두었습니다(그림 7C). 그런 다음 엑소좀 염료 혼합물을 증류수로 추가 50배로 희석하여 NTA 측정에 적합한 최종 엑소좀 농도를 만들었습니다(그림 7D).

그림 7: Quant-iT™ RiboGreen을 이용한 엑소좀 RNA 라벨링 단계를 보여주는 도식. A - 엑소좀 작업용 스톡 C 준비 , B - Quant-iT™ RiboGreen 준비, C - 라벨링 혼합물 준비 및 배양, D - Quant-iT™ RiboGreen - RNA로 라벨링된 엑소좀의 최종 희석.

3.3 나노입자 추적 분석(NTA)

나노 입자 추적 분석(NTA) 측정은 488nm 및 532nm 레이저가 장착된 NanoSight Pro에서 NS Xplorer 소프트웨어(버전 1.0)를 사용하여 수행했습니다.

표 1[16], [17], [18], [19], [20]에 나와 있는 것처럼 염료 여기 및 방출 속성에 따라 각 형광 측정에 적합한 레이저 파장과 형광 장파역 필터를 적용했습니다. PE/Cyanine7은 매우 넓은 여기 스펙트럼을 가지고 있어서 여러 파장을 사용하여 형광을 유도/발현시킬 수 있습니다. 가장 강력한 NTA 형광 신호를 생성한 파장의 488nm 레이저를 PE/Cyanine7로 라벨링된 엑소좀에 대해 선택했습니다. 

형광 염료	형광단 여기 최대값	NanoSight Pro 레이저 파장[nm]	형광단 방출 최대값	NanoSight Pro 광파역 형광 필터[nm]
CellMask™ Orange	556	532	571	565LP
ExoGlow™	465	488	635	500LP
PE/Cyanine7	565	488/532	778	500LP/565LP
Alexa Fluor® 488	496	488	519	500LP
Quant-iT™ RiboGreen	500	488	525	500LP

표 1: 형광 NTA 측정에 필요한 형광 염료 및 해당 여기 파장 및 광파역 필터

NS Xplorer 소프트웨어에는 단일 측정 내에서 산란과 형광의 결합된 분석을 수행하는 통합 형광 모드가 있어서 크기 분포뿐만 아니라 농도 및 형광 효율성도 직접 보고합니다. 형광 효율성은 단일 실험 내에서 형광 필터를 사용한 경우와 사용하지 않은 경우의 농도를 비교하여 샘플에서 형광을 띄는 입자 비율을 제공합니다.

종합 형광 분석을 위해, 광산란과 형광 부분 모두에 대해 각각 150 프레임 기간, 10개 캡처의 기본 설정을 사용했습니다. 자동 카메라 및 초점 설정은 측정의 분산 부분에서 사용하고, 수동 카메라 및 초점 설정은 형광 부분에서 사용했습니다. 형광의 경우, 최대 카메라 설정(노출 시간 = 40ms, 대비 게인 = 15.8)을 사용했습니다. 모든 샘플은 약 5µl/min의 유속으로 측정했습니다. 일관성과 비교를 위해 모든 샘플 대조군은 동일한 형광법으로 분석했습니다. NS Xplorer에서 데이터는 사용자 입력이 필요하지 않은 입자 검출을 위한 기계 학습 훈련 알고리즘을 사용하여 자동으로 처리됩니다. 사용자 편향을 제거하면 더 재현 가능한 데이터를 생성할 수 있습니다.

각 라벨링에 대한 데이터 표현이 제시되어 있습니다. 원시 크기 분포 모드는 세포외 소포(직경, nm)의 크기 매개변수로 기록했습니다. 농도 및 형광 라벨링 효율성도 NS Xplorer 소프트웨어로 측정했습니다. 

4.0 결과 및 논의

4.1 대조군 엑소좀

대조군 EV는 488nm와 532nm 레이저와 각각 500nm와 560nm의 장파역 필터를 사용하여 측정했습니다. 예상대로 샘플은 광산란에서 성공적으로 분석되었으며, 라벨링되지 않은 EV의 형광 신호는 레이저와 해당 LP 필터 모두에서 검출되지 않았습니다.

EV에는 자가 형광이 나타나지 않았고 형광 분포가 생성되지 않아 0%의 형광 효율성을 보였습니다. 그림 8은 종종 생물학적 샘플에 대해 예상되는 일반적인 이종 분포를 나타내는 엑소좀의 크기 분포를 보여줍니다.

그림 8: 488nm 레이저와 500nm 장파역 필터(주황색), 532nm 레이저와 560nm 장파역 필터(파란색)를 사용하여 측정한 소변 유래 대조군 엑소좀의 산란 크기 분포

3.9 × 10⁸입자/mL 및 4.5 × 10⁸입자/mL의 농도와 77.5nm 및 82.5nm의 모달 크기는 각각 532nm 및 488nm 레이저를 사용하여 측정했습니다. 엑소좀의 고유한 이질성과 이러한 측정을 여러 날에 걸쳐 수행했다는 사실을 고려했을 때, 해당 농도의 변동성이 관찰되었습니다. 그러나 크기 분포 프로파일은 일관되게 유사한 형태를 유지했습니다. 또한 샘플을 부피 기반으로 희석함에 따라 일부 농도 변동 레벨도 예상되었으며, 이는 이 희석 방법에 대해 예상된 오류 범위 내에 있었습니다. NTA의 경우 형광단 추가가 샘플의 고유한 특성에 영향을 미치는지 확인하기 위해 라벨링한 샘플와 같은 날에 대조군 측정을 수행하는 것이 가장 좋습니다.

4.2 막 라벨링

일반 CMO 및 ExoGlow™ 염료는 EV 막에 쉽게 통합되므로, 형광 필터를 사용하거나 사용하지 않고도 전체 EV 농도를 확인할 수 있습니다(Carnell-Morris 외, 2017[14]), [21]. 두 염료는 모두 약 100%의 형광 효율성을 보였습니다. 이는 샘플 내 모든 입자가 형광으로 라벨링되었음을 나타냅니다(CMO의 경우 102%, ExoGlow™의 경우 96%). 

CMO 및 ExoGlow™ 라벨링에 대한 산란 및 형광 크기 분포는 그림 9에 나와 있습니다. 두 염료의 경우, 산란과 형광 크기 분포가 동일한 모양을 가지고 겹쳐지는데, 이는 전체 샘플 크기 분포 범위가 성공적으로 라벨링되었음을 나타냅니다. 또한, 라벨링된 엑소좀의 분포가 EV 대조 분포와 거의 일치하여 라벨링 과정이 엑소좀의 원래 크기 및 농도에 영향을 미치지 않는다는 것을 보여줍니다.

그림 9: a) CMO 및 b) ExoGlow™ 막 염료로 라벨링된 건강한 공여자의 소변에서 엑소좀의 산란(파란색) 및 형광(주황색) 크기 분포. 라벨링되지 않은 대조군 EV 크기 분포는 검은색으로 표시됩니다.

막 라벨링된 EV의 모달 크기 및 입자 농도 데이터는 표 2에 나와 있습니다. 보고된 두 염료 간의 농도 및 크기 차이는 다른 날에 수행된 샘플 준비 및 측정의 결과일 가능성이 높습니다.

각 캡처의 농도를 사용하여 라벨링된 엑소좀 샘플 모두에 대한 산란과 형광의 농도에 대해 t 검정을 수행했습니다. CMO로 라벨링된 엑소좀은 p값이 0.741이었고 엑소글로우로 라벨링된 엑소좀은™ 0.288로, CMO와 Exoglow™ 모두에 대한 산란과 형광 농도가 0.95의 신뢰 수준으로 통계적으로 동일함을 확인했습니다.

두 염료는 모두 효과적으로 소변 엑소좀을 염색했지만 광안정성 특성은 상당히 달랐습니다. 형광단이 높은 강도의 레이저 광선에 노출될 때 형광 과정이 중단되거나 중지될 수 있습니다. 광안정성 특성은 개별 형광단에 특이적이며, 형광 과정/신호가 얼마나 오래 유지될 수 있는지를 알려줄 수 있습니다. NS Xplorer 소프트웨어의 형광 감쇠 그래프를 사용하여 염료의 광안정성을 평가했습니다. CMO 염색 엑소좀 신호는 ExoGlow™보다 형광 필터에서 밝고 광안정성이 더 높았습니다. 이는 CMO 염색 엑소좀의 프레임당 입자가 캡처 기간 동안 변하지 않고 남아 있기 때문입니다(그림 10A). ExoGlow™로 염색된 엑소좀의 경우, 형광 신호가 점점 희미해지면서, 프레임별 입자 수가 감소하는 날카로운 감쇠 곡선 관찰되었습니다(그림 10b). 매우 짧은 시간 동안만 관찰되었지만, NS Xplorer 소프트웨어에서 라벨링된 엑소좀을 성공적으로 추적하고 크기를 조정하며 계수했습니다.

EV 막 라벨링은 정제 공정의 성공 여부를 확인하기 위해 일반적으로 사용되는 간단하고 빠르며 효과적인 기술입니다. 그러나 선택성이 부족하다는 것은 공동 정제된 잔해도 라벨링될 가능성이 있다는 것을 의미합니다. 그 결과 특정 항체 라벨링을 활용하면 EV의 존재를 보다 안정적으로 확인할 수 있습니다.

그림 10: NS Xplorer 소프트웨어의 형광 감쇠 그래프는 a) CMO의 광안정성 속성 및 b) ExoGlow™의 광표백 특성으로 라벨링된 건강한 공여자의 소변에서 유래한 엑소좀에 대한 150개 프레임 형광 비디오의 지속 시간에 따라 프레임당 평균 입자가 어떻게 변하는지 보여줍니다.

	대조 용액		산란		형광		형광 효율성[%]
	모드[nm]	농도[입자/ml]	모드[nm]	농도[입자/ml]	모드[nm]	농도[입자/ml]
CellMask™ Orange	77.5	3.89 × 108	92.5	2.37 × 108	97.5	2.41 × 108	102
ExoGlow™	82.5	4.46 × 108	107.5	4.56 × 108	92.5	4.39 × 108	96

표 2: NanoSight Pro에서 형광 NTA를 사용하여 CMO 및 ExoGlow™ 막 염료로 라벨링한 경우, 산란 및 형광 모드에서 측정한 건강한 공여자의 소변에서 엑소좀의 모드(nm) 및 농도(입자/mL)

4.3 특정 라벨링

각 Alexa Fluor® 488 및 PE/Cy7 염료 항체에 대해 NanoSight Pro에서 측정한 형광 농도는 준비한 소변 샘플의 엑소좀 내 테트라스파닌 바이오마커의 존재를 확인하고 특정 표면 테트라스파닌이 있는 엑소좀 농도를 측정하기 위해 사용했습니다. 그림 11은 특히 항CD9, 항CD63, 항CD81 항체 염료로 라벨링된 소변에서 엑소좀의 광산란 및 형광 조건 하에 NanoSight Pro 측정 시 측정된 농도를 보여줍니다. 

Alexa Fluor® 488 및 PE/Cyanine7 엑소좀의 모달 크기 및 입자 농도 데이터는 표 3에 라벨링 효율과 함께 나와 있습니다. PE/Cyanine7로 라벨링된 EV는 Alexa Fluor® 488로 라벨링된 EV보다 크기가 더 큰 것으로 측정되었습니다. 이는 PE/Cyanine7 형광단(분자량 = 240kDa, [18])이 Alexa Fluor® 488(분자량 = 800Da, [16])보다 크기 때문일 수 있습니다. PE/Cyanine7이 부착된 EV는 직경이 더 클 수 있습니다. 그러나 크기 분포 형태 및 범위는 유사하게 유지됩니다.

그림 11: NanoSight Pro를 이용한 형광 NTA 측정에서 Alexa Fluor 488 및 PE/Cyanine7 결합 항CD9, 항CD63, 항CD81 항체 염료로 라벨링된 엑소좀의 산란 및 형광 측정 시 입자 농도.

		산란		형광	형광 효율성[%]
		모드[nm]	농도[입자/ml]	농도[입자/ml]
Alexa Fluor® 488	CD9	92.5	3.96 × 108	1.59 × 108	40
	CD63	87.5	4.15 × 108	1.92 × 108	46
	CD81	87.5	4.39 × 108	1.44 × 108	33
PE/Cyanine7	CD9	107.5	5.49 × 108	1.93 × 108	35
	CD63	107.5	4.32 × 108	8.00 × 107	19
	CD81	92.5	4.24 × 108	4.10 × 107	10

표 3: Alexa Fluor 488 및 PE/Cyanine7 CD9, CD63 및 CD81 항체 염료로 라벨링되고 NanoSight Pro에서 형광 NTA를 이용하여 산란과 형광 모드로 측정한 건강한 공여자의 소변 내 엑소좀의 모드(nm 단위) 및 농도(입자/mL 단위) 

형광 효율성은 각 형광 염료의 테트라스파닌 농도를 비교하는 데 유용한 매개변수입니다. CD9 라벨링의 경우, Alexa488과 PE/Cyanine7 염료를 사용하여 각각 40%와 35%의 보고된 형광 효율을 달성했습니다. CD63 라벨링의 경우, 46%와 19%를 달성했고, CD81 라벨에 대해 33%와 10%를 달성했습니다. Alexa Fluor® 488은 PE/Cyanine7보다 높은 형광 효율성을 제공했습니다. 이는 PE/Cyanine7의 입체 장애 때문일 수 있습니다. 형광단의 규모가 훨씬 크므로 존재하는 모든 테트라스파닌과 결합하지 못할 수 있으며, 따라서 형광 농도가 낮아지고 효율성이 낮아집니다. 2016년 Oliveira ‐ Rodríguez 외의 연구에 따르면 건강한 공여자의 소변 내 엑소좀에는 높은 농도의 CD9 및 CD63가 나타나 이 연구에서 보고된 라벨링 효율성과 잘 일치합니다[13].

PE/Cyanine7 및 Alexa Fluor® 488 염료를 사용한 CD9, CD63, CD81 라벨링 크기 분포의 예는 그림 12에 나와 있습니다. 모든 경우에서, 형광 크기 분포는 산란 크기 분포보다 넓은 분포를 나타내고 있었습니다. 이는 예상했던 것이었으며, 형광 효율성에 반영되었습니다.

그림 12: 산란으로 측정하고 (파란색) a) PE/Cyanine7 CD9, b) Alexa 488 CD9, c) Alexa 488 CD63 및 d) Alexa 488 CD81 항체 염료로 라벨링되는 형광(주황색)으로 측정한 소변의 엑소좀 분포.

4.4 RNA 라벨링

RNA 라벨링의 경우, Quant-iT™ RiboGreen을 RNA 염료로 사용했을 때 54%의 효율성을 달성했습니다. 이는 약 절반의 엑소좀이 RNA를 포함하고 있을 가능성이 있다는 것을 의미합니다. 표 4와 같이, 산란 농도는 2.3 × 108 입자/mL로 측정되었고, 형광 농도는 1.2 × 108 입자/mL로 측정되었습니다. 

	산란		형광	형광 효율성[%]
	모드[nm]	농도[입자/ml]	농도[입자/ml]
Quant-iT™ RiboGreen	82.5	2.29 × 108	1.23 × 108	54

표 4: 형광 NTA를 사용하여 Quant-iT™ RiboGreen으로 라벨링한 경우, 산란 및 형광 모드에서 측정한 건강한 공여자의 소변에서 엑소좀의 모드(nm) 및 농도(입자/mL) 

크기 분포는 그림 13에 나와 있습니다. 산란 크기 분포가 대조군 크기 분포와 일치하여 라벨링이 EV의 크기 분포 및 농도에 영향을 미치지 않는다는 것을 보여줍니다. NS Xplorer 소프트웨어의 형광 감쇠 그래프는 Quant-iT™ RibobGreen으로 라벨링된 엑소좀에 대한 150개 프레임 형광 비디오의 지속 시간에 따라 프레임당 평균 입자가 어떻게 변하는지 보여줍니다(그림 14).

그림 13: Quant-iT™ RiboGreen RNA 라벨링된 엑소좀의 산란(파란색) 및 형광(주황색) 크기 분포. 대조군 EV 크기 분포는 검은색으로 표시됩니다. 

Quant-iT™ RiboGreen은 프레임당 입자 수가 크게 감소하므로 그림 14와 같이 상대적으로 불안정한 광안정성을 보입니다. 

그림 14: Quant-iT™ RibobGreen으로 라벨링된 엑소좀에 대한 150개 프레임 형광 비디오의 지속 시간에 따라 프레임당 평균 입자가 어떻게 변하는지 보여주는 NS Xplorer 소프트웨어의 형광 감쇠 그래프

5.0 결론

NanoSight Pro는 크기, 크기 분포, 농도 측정 및 형광 모드 모두에 대해 개별 입자를 추적할 수 있을 뿐만 아니라 형광 라벨링 기능을 통해 용이하게 엑소좀을 검출할 수 있어 EV 특성 분석에 점점 더 많이 활용되고 있는 유용한 도구로 부상하고 있습니다. 이 백서는 NanoSight Pro를 사용하여 다양한 라벨링 방법을 통해 EV의 다양한 특성을 밝혀낼 수 있는 방법을 보여줍니다. 

형광 NTA를 통한 EV의 하위 모집단은 염료 특성(예: 광안정성 및 밝기), 샘플 방법 준비(예: 항체 친화성 및 특이성, 배양 조건) 및 측정 조건(예: 샘플 제시, 기기 설정, 측정 기간)에 관한 몇 가지 간단한 규칙을 따라 탐지됩니다.

처음에, 소변 유래 세포외 소포(EVS)는 크기, 크기 분포 및 농도의 이질성 면에서 효과적으로 특성화되어 대조 측정의 역할을 수행했습니다. 뿐만 아니라, 확실한 광안정성을 가진 두 가지 다른 형광 염료를 사용하여 성공적인 막 라벨링을 입증했습니다(CellMask™ Orange 및 ExoGlow™). 두 염료 모두 약 100% 라벨링 효율성을 나타냈으며 소변 유래 EV의 존재 및 순도를 확인하고 Exoglow 같은 더 많은 광표백 염료에서도 형광 신호를 정확하게 측정할 수 있는 NanoSight Pro의 기능을 보여줍니다. 바이오마커 탐지 방법은 두 가지 다른 염료, Alexa Fluor® 488 (488 nm의 여기 파장)과 Pe/Cyanine (488 또는 532 nm의 여기 파장)을 사용하여 개발했습니다. 두 염료 모두에서 CD9, CD63, CD81 바이오마커의 존재가 확인되었으며, Alexa Fluor® 488은 두 염료의 다른 특성으로 인해 약간 높은 형광 라벨링 효율을 나타냈습니다. 마지막으로, Quant-iT™ RiboGreen 염료를 사용하여 운반 물질 검출 방법을 성공적으로 확립하여 52%의 RNA 라벨링 효율성을 보여주었습니다.

광범위하게 입증된 바처럼, 특수 형광 모드를 갖춘 NanoSight Pro는 진단 및 치료 응용 분야 모두에서 세포외 소포(EV)에 관한 연구 및 개발 노력을 발전시키는 데 있어 무한한 역량을 보유하고 있습니다.

6.0 참고 문헌  

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7. Wang, J., Yue, B.-L., Huang, Y.-Z., Lan, X.-Y., Liu, W.-J., & Chen, H. (2022). Exosomal RNAs: Novel Potential Biomarkers for Diseases—A Review. International Journal of Molecular Sciences, 23(5), 2461. https://doi.org/10.3390/ijms23052461

8. Van Der Pol, E., Hoekstra, A. G., Sturk, A., Otto, C., Van Leeuwen, T. G., & Nieuwland, R. (2010). Optical and non‐optical methods for detection and characterization of microparticles and exosomes. Journal of Thrombosis and Haemostasis, 8(12), 2596-2607. 

9. Kurian, T. K., Banik, S., Gopal, D., Chakrabarti, S., & Mazumder, N. (2021). Elucidating Methods for Isolation and Quantification of Exosomes: A Review. Molecular Biotechnology, 63(4), 249-266. 

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13. Oliveira‐Rodríguez, M., López‐Cobo, S., Reyburn, H. T., Costa‐García, A., López‐Martín, S., Yáñez‐Mó, M., Cernuda‐Morollón, E., Paschen, A., Valés‐Gómez, M., & Blanco‐López, M. C. (2016). Development of a rapid lateral flow immunoassay test for detection of exosomes previously enriched from cell culture medium and body fluids. Journal of Extracellular Vesicles, 5(1), 31803. 

14. Carnell-Morris, P., Tannetta, D., Siupa, A., Hole, P., & Dragovic, R. (2017). Analysis of Extracellular Vesicles Using Fluorescence Nanoparticle Tracking Analysis. In W. P. Kuo & S. Jia (Eds.), Extracellular Vesicles (Vol. 1660, pp. 153-173). Springer New York. 

15. HansaBiomed. 출처: 2024년 3월 13일, https://hansabiomed.eu/shop/image/catalog/Inserts/Exo%20standards.pdf

16. FluoroFinder. (n.d.-a). 출처: 2024년 2월 26일, https://app.fluorofinder.com/dyes/5-alexa-fluor-488-ex-max-490-nm-em-max-525-nm

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19. FluoroFinder. (n.d.-c). 출처: 2024년 2월 26일, https://app.fluorofinder.com/dyes/1615-cellmask-orange-plasma-membrane-stain-ex-max-556-nm-em-max-571-nm

20. Quant-itTM RiboGreen RNA Assay Kit 및 RiboGreen RNA Reagent, RediPlateTM 96 RiboGreenTM RNA Quantitation Kit. (n.d.). 출처: 2024년 2월 26일, https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/R11490

21. Igami, K., Uchiumi, T., Shiota, M., Ueda, S., Tsukahara, S., Akimoto, M., Eto, M., & Kang, D. (2022). 방광암 환자의 소변에서 CEACAM 단백질을 발현하는 세포외 소포. Cancer Science, 113(9), 3120-3133. 

개정 정보  초판, 2024년 4월

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