3 maneiras de analisar dados de GPC/SEC

Adquirir dados de qualidade de GPC/SEC é apenas metade da batalha. Uma vez que os dados estão em mãos, você precisa de uma maneira de transformar esses cromatogramas em valores numéricos significativos, como peso molecular. Existem várias maneiras de fazer isso, dependendo de qual combinação de detectores você tem disponível. Este post discutirá os três métodos mais comuns de análise de dados de GPC/SEC (todos disponíveis no OMNISEC!): calibração convencional, calibração universal e multi-detecção com espalhamento de luz.

Para uma apresentação em vídeo que inclua o material a seguir (e mais!), por favor assista ao meu Vídeo de introdução ao GPC/SEC em 30 minutos.

Calibração convencional

A configuração mais simples de GPC/SEC é um sistema de detector único, usando uma bomba, conjunto de colunas e um detector de índice de refração (RI) ou UV. Um desses detectores é escolhido porque respondem diretamente à concentração da amostra, o que é importante para calcular momentos de peso molecular, como Mw e Mn. Para obter valores de peso molecular a partir de uma calibração convencional (às vezes referida como calibração de coluna), uma série de padrões bem caracterizados devem ser executados. Esses padrões são usados para gerar uma curva de calibração que mapeia qual peso molecular (peso molecular do pico ou Mp) corresponde a cada volume de retenção, conforme ilustrado na figura abaixo.

Quando uma amostra desconhecida é analisada, o peso molecular de cada fatia de dados é determinado com base no seu volume de retenção e no peso molecular correspondente na curva de calibração em uso. Como os valores de peso molecular obtidos usando calibração convencional dependem dos padrões usados para gerar a curva de calibração, os resultados para uma amostra são descritos como valores de peso molecular relativos.

A vantagem da calibração convencional é que é a configuração de GPC/SEC mais econômica, apresentando o menor número de componentes e cálculos mais simples. A desvantagem é que os valores de peso molecular obtidos podem não refletir com precisão suas amostras se a estrutura molecular, e assim a forma e o tamanho, de suas amostras forem diferentes dos seus padrões. E com um sistema de detector único, os dados calculados podem não representar as características reais da sua amostra e podem até mesmo desviar sua pesquisa. Em outras palavras, você pode estar em uma situação em que não sabe o que não sabe!

Veja a calibração convencional em ação com o OMNISEC!

Calibração universal

A adição de um detector de viscosidade a um detector de concentração (mais frequentemente um detector de RI) permite que uma curva de calibração universal seja aplicada a uma amostra desconhecida. Além dos momentos de peso molecular, outros parâmetros moleculares, como viscosidade intrínseca (IV), raio hidrodinâmico (Rh) e parâmetros de Mark-Houwink, podem ser determinados.

A resposta do detector de viscosidade é afetada pela estrutura molecular da amostra; mais especificamente pela sua forma em solução. Portanto, a presença do viscosímetro leva em consideração diferenças estruturais entre os padrões usados para gerar a curva de calibração e as amostras em análise, proporcionando dados mais precisos do que os obtidos pela calibração convencional.

Em 1967, Benoit et. al. usaram a relação entre volume hidrodinâmico, peso molecular e viscosidade intrínseca (equação acima) para mostrar que a curva de calibração para polímeros de diferentes tipos pode se fundir em uma única curva de calibração. Lembre-se de que GPC/SEC separa com base no tamanho molecular, ou volume hidrodinâmico. Portanto, se pensarmos no volume de eluição como sendo essencialmente volume hidrodinâmico, podemos plotar peso molecular vezes viscosidade intrínseca contra volume hidrodinâmico. Isso significa que todos os polímeros, independentemente de sua estrutura e forma, estarão ao longo da mesma curva de calibração, universal, como mostrado na imagem abaixo.

A vantagem da calibração universal é que você pode obter valores precisos de peso molecular para suas amostras, independentemente dos padrões que você tiver disponível. Além disso, a inclusão de um detector de viscosidade oferece mais dados de caracterização, incluindo IV, Rh, e parâmetros de Mark-Houwink.

No entanto, mesmo que a identidade dos padrões não importe, uma curva de calibração ainda é necessária e, portanto, cada sistema de GPC/SEC terá uma curva de calibração única. Parâmetros como colunas, fase móvel, taxa de fluxo e temperatura ainda afetarão a curva de calibração resultante.

Veja a calibração universal em ação com o OMNISEC!

Análise por multi-detecção com espalhamento de luz

Às vezes chamada de Deteção Tripla, Deteção Avançada, SEC-MALS, entre outros, este método utiliza um detector de espalhamento de luz em combinação com um detector de concentração, no mínimo, para calcular o peso molecular absoluto. Isso funciona porque a intensidade da luz espalhada está relacionada ao peso molecular de uma amostra. Detectores de viscosidade e/ou UV-Vis são frequentemente adicionados para criar uma ferramenta analítica de multi-detecção poderosa.

Conforme descrito em detalhes neste post sobre GPC/SEC de multi-detector, cada detector responde a um aspecto diferente da amostra, o que permite o cálculo de peso molecular absoluto (preciso e não dependente de uma curva de calibração), IV, Rh, Rg, parâmetros de Mark-Houwink, concentração e potencialmente dados de ramificação e análise de composição. As equações que regem a resposta de cada detector são mostradas abaixo.

Além de fornecer peso molecular absoluto, a multi-detecção com um detector de espalhamento de luz é vantajosa porque não depende de uma curva de calibração. O processo de calibração simples envolve executar um padrão estreito único, tão frequentemente quanto você achar necessário. Recomendamos verificar a calibração com um padrão de verificação… mas é isso!

Uma vez que você tenha um método calibrado, calcular dados para suas amostras é fácil – confira com o OMNISEC no vídeo abaixo!

Considerações finais

Em conclusão, espero que este post ajude você a diferenciar entre os três métodos de análise comuns disponíveis para dados de GPC/SEC. Existem vantagens em cada um deles, mas a precisão e conveniência da multi-detecção com espalhamento de luz a distingue das demais como o método ideal para analisar dados de GPC/SEC. Se você tiver alguma dúvida, por favor, não hesite em nos contatar ou me enviar um e-mail diretamente para kyle.williams@malvernpanalytical.com.

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