Qual é o melhor detector de espalhamento de luz para mim?
Determinar qual sistema de cromatografia de permeação em gel/cromatografia de exclusão por tamanho (GPC/SEC) é o melhor para suas necessidades pode ser uma tarefa desafiadora. Mesmo depois de decidir incluir um detector de espalhamento de luz para obter dados de peso molecular absoluto, você ainda precisa escolher entre duas opções: um detector de espalhamento de luz multiângulo (MALS) ou um detector de espalhamento de luz de ângulo reto e ângulo baixo (RALS/LALS). Ambas as configurações de espalhamento de luz fornecerão o peso molecular absoluto de uma amostra, mas utilizam diferentes abordagens para esse objetivo comum. Felizmente, a Malvern Panalytical oferece ambos; a unidade modular SEC-MALS 20 que pode se conectar ao OMNISEC, o TDAmax ou outros sistemas de terceiros, e um detector RALS/LALS integrado nos sistemas GPC/SEC completos OMNISEC e TDAmax. Neste post, discutirei os detectores MALS e RALS/LALS e, esperançosamente, fornecer informações relevantes que permitam determinar qual configuração é melhor para você e sua aplicação.
Para começar, vamos dar um passo atrás e discutir brevemente alguma teoria sobre espalhamento de luz (para uma discussão mais detalhada sobre espalhamento de luz estático, consulte nosso white paper previamente publicado sobre o assunto). A razão pela qual os detectores de espalhamento de luz funcionam é porque a intensidade da luz espalhada por uma molécula é diretamente proporcional ao seu peso molecular. Quanto maior o peso molecular, maior a intensidade da luz espalhada. Essa relação é destacada pela equação de Rayleigh, mostrada abaixo, onde RΘ representa a intensidade da luz espalhada em um determinado ângulo Θ e Mw é o peso molecular de uma amostra.
Além disso, o ângulo de observação da luz espalhada desempenha um papel. Amostras relativamente pequenas com um raio de 10-15 nm ou menores são conhecidas como espalhadores isotrópicos, o que significa que espalham luz da mesma forma em todas as direções. Isso significa que a intensidade da luz observada no detector de 90° é a mesma que a intensidade da luz observada em um detector colocado a 15°, 45°, 135°, etc. Amostras maiores do que a faixa de 10-15 nm são afetadas por interferência, já que a amostra é grande o suficiente para espalhar a luz várias vezes antes de alcançar o detector. O resultado é que a intensidade da luz espalhada por amostras grandes varia dependendo do ângulo de observação. A dependência angular da intensidade da luz espalhada significa que diferentes pesos moleculares podem ser calculados com base na colocação do detector. Para minimizar os efeitos de interferência, o ângulo de observação ideal para a intensidade da luz espalhada de amostras grandes é o ângulo de 0°. Do ponto de vista prático, isso é impossível, pois o detector seria incapaz de discernir entre a luz espalhada pela amostra e a luz do feixe incidente. As soluções para este problema – observar a intensidade da luz espalhada no ângulo de 0° – são representadas pelas configurações de detectores MALS e RALS/LALS.
Um detector MALS normalmente emprega de três a vinte detectores, dispostos em vários ângulos ao redor da célula de fluxo da amostra. Um detector de 90° geralmente está incluído, e os detectores restantes podem variar de 12° a 168°. Um detector MALS faz medições da luz espalhada em diversos ângulos, ajusta os dados a um modelo e extrapola de volta para 0° para determinar o peso molecular da amostra. Se a amostra for um espalhador isotrópico, então cada ponto de dados representará a mesma intensidade de espalhamento e a extrapolação de volta para 0° será uma linha reta. Se a amostra for grande o suficiente para mostrar dependência angular, então as diferenças na intensidade da luz espalhada, com base no ângulo de observação, se tornarão aparentes. Ambos os exemplos são mostrados nos gráficos parciais de Zimm abaixo.
Gráficos parciais de Zimm mostrando vários ângulos de uma resposta MALS; Esquerda: uma amostra mostrando espalhamento isotrópico com a mesma intensidade em todos os ângulos; Direita: uma amostra mostrando dependência angular, conforme evidenciado pela inclinação do gráfico
A disposição do detector RALS/LALS é composta por detectores de 90° e 7°, criteriosamente escolhidos por sua natureza complementar. Para amostras com raio de 10-15 nm e menores, o detector de 90° é ideal porque está situado a um ângulo reto do feixe incidente, o que maximiza a relação sinal/ruído. Como amostras menores espalham luz com a mesma intensidade em todas as direções, o detector RALS oferece a resposta ideal para uma medição direta do peso molecular de uma amostra. Para amostras com raio maior do que a faixa de 10-15 nm que apresentam dependência angular, o detector LALS fornece uma medição a 7°, que é a posição mais baixa disponível para o detector. A colocação a 7° significa que o detector está essencialmente fazendo uma medição direta do peso molecular da amostra e evita a necessidade de qualquer ajuste e extrapolação. É importante notar que o detector LALS é preciso para amostras de todos os tamanhos, entretanto, devido à menor intensidade da luz espalhada fornecida por amostras menores e de menor peso molecular, o RALS proporciona um sinal mais limpo devido ao seu posicionamento ortogonal à fonte de luz incidente.
Gráficos parciais de Zimm mostrando a medição direta do peso molecular; Esquerda: a resposta RALS de 90° para medição de uma amostra mostrando espalhamento isotrópico; Direita: a resposta LALS de 7° para medição de uma amostra mostrando dependência angular
Para determinar o detector de espalhamento de luz mais apropriado para suas necessidades, você deverá considerar sua aplicação, a informação que está buscando e sua preferência pessoal. Tanto os detectores MALS quanto RALS/LALS têm vantagens e desvantagens que podem torná-los mais adequados para uma situação ou outra, mas a boa notícia é que ambos podem ser confiáveis para fornecer resultados precisos!
Por exemplo, se seu principal alvo de análise é uma amostra relativamente grande de alto peso molecular, ambas as configurações de detector MALS e RALS/LALS são projetadas para lidar com a faixa completa de pesos moleculares presentes em sua amostra. No entanto, se você está principalmente interessado em analisar materiais pequenos, de baixo peso molecular, então um detector RALS será capaz de lidar com a maioria de suas análises. Ter um detector LALS complementar garantirá que qualquer fracção grande de sua amostra, ou agregados potenciais, seja observada com precisão, mesmo se existirem em baixa concentração dentro de sua amostra. Um detector MALS pode determinar o peso molecular correto, mas dado que todos os detectores observarão a mesma intensidade de luz espalhada para amostras pequenas, de espalhamento isotrópico, obter o mesmo resultado várias vezes pode acabar se tornando redundante.
O exemplo acima acontece frequentemente para cientistas que estudam proteínas. Devido à natureza ordenada de suas estruturas, as proteínas são moléculas relativamente densas, o que significa que mesmo espécies de alto peso molecular são relativamente pequenas. Mesmo proteínas com pesos moleculares tão altos quanto 700 kDa possuem apenas um raio de 10-12 nm. O potencial para altos pesos moleculares mas tamanhos moleculares relativamente pequenos significa que as proteínas são tipicamente espalhadores isotrópicos e são amostras ideais para um detector RALS/LALS. Nesse caso, o detector RALS seria o detector principal utilizado para cálculos, com o detector LALS capturando agregados ou componentes maiores na amostra. Visto que proteínas são geralmente espalhadores isotrópicos, não há benefício adicional em ter vários detectores em diferentes ângulos incluídos em um detector MALS.
Para ilustrar este ponto, os pesos moleculares de várias proteínas foram medidos usando tanto um detector RALS quanto um MALS. Os dados resultantes são apresentados na figura abaixo, na qual é claro que os mesmos pesos moleculares são obtidos de ambos os detectores. Isso confirma que um detector RALS fornece os mesmos resultados que um detector MALS para amostras que mostram espalhamento isotrópico.
Pesos moleculares de proteínas calculados usando detectores RALS e MALS; Pesos moleculares em kDa
Se você está interessado não só no peso molecular, mas também no tamanho molecular, então um detector MALS oferece a capacidade de calcular o raio de giro (Rg) de uma amostra. No entanto, há uma ressalva: isso só é possível para amostras com raio maior que 10-15 nm, uma vez que o Rg é calculado a partir da inclinação gerada pela dependência angular no gráfico parcial de Zimm. Se a amostra for um espalhador isotrópico, então não há inclinação e o Rg não pode ser determinado. Como um adendo, o raio hidrodinâmico (Rh) de amostras até alguns nm pode ser determinado combinando os dados de viscosidade intrínseca (IV) de um detector de viscosímetro com os dados de peso molecular obtidos de um detector de espalhamento de luz.
Além disso, pode haver alguns itens práticos a considerar específicos para sua aplicação. Se você está integrando vários detectores, particularmente para aplicações de UPLC, por exemplo, a célula de fluxo menor presente no detector RALS/LALS pode ser benéfica. Alternativamente, se você já sofreu anteriormente com contaminação de uma célula de espalhamento de luz, pode achar que uma orientação específica da célula (como a célula de fluxo vertical no SEC-MALS 20) oferece robustez e confiabilidade adicionais.
É claro que a preferência pessoal é sempre um fator ao decidir sobre um detector de espalhamento de luz. Talvez você sempre tenha usado um detector MALS e esteja mais confortável calculando pesos moleculares usando um modelo de extrapolação específico. Ou talvez você prefira a simplicidade e a objetividade da abordagem RALS/LALS para calcular o peso molecular. Ou talvez você esteja trabalhando dentro de um orçamento e queira maximizar o valor do seu instrumento.
Quero comentar rapidamente sobre este último item, já que é algo com o qual todos podemos nos identificar. O custo dessas unidades de detector aumenta de acordo com o número de detectores de espalhamento de luz individuais presentes. Na configuração RALS/LALS, há dois detectores; no SEC-MALS 20, há vinte. Os preços variam de acordo. Não há desvantagem prática em ter a gama de ângulos disponíveis em um detector MALS, mas como discutido acima em relação a espalhadores isotrópicos, os ângulos adicionais nem sempre fornecem informações adicionais.
E embora não seja a rota mais eficiente em termos de custo, você pode até mesmo ter detectores MALS e RALS/LALS no mesmo sistema, coletar os dados simultaneamente e depois decidir qual usar para cálculos durante a análise de dados.
Espero ter fornecido informações suficientes neste post para ajudá-lo a determinar se um detector MALS, RALS/LALS (ou ambos!) é o mais adequado para você e sua aplicação. Qualquer que seja a sua escolha, estamos aqui para ajudar!
Posts anteriores:
Este artigo pode ter sido traduzido automaticamente
{{ product.product_name }}
{{ product.product_strapline }}
{{ product.product_lede }}
