Como funciona a GPC/SEC de múltiplos detectores?

Seja para polímeros sintéticos, materiais naturais como polissacarídeos, ou proteínas, anticorpos ou outras amostras biológicas, a cromatografia por permeação de gel / cromatografia de exclusão por tamanho (GPC/SEC) é a técnica ideal para caracterizar esses e outros tipos de macromoléculas. As informações fornecidas pela análise GPC/SEC incluem peso molecular (MW), tamanho molecular na forma de raio hidrodinâmico (Rh) e raio de giro (Rg), viscosidade intrínseca (IV), concentração, análise composicional e dados de ramificação, entre outros parâmetros. Os dados disponíveis dependem da combinação de detectores presente, à medida que vários detectores se combinam para oferecer diferentes peças do quebra-cabeça da caracterização. Este post vai detalhar como os diferentes detectores, disponíveis nas plataformas OMNISEC e Viscotek TDA, trabalham juntos para fornecer uma caracterização abrangente de uma amostra. Para mais detalhes (e equações!), consulte nosso documento técnico sobre os princípios da GPC/SEC de múltiplos detectores.

Os relacionamentos entre detectores e parâmetros moleculares estão resumidos graficamente na figura acima. O gráfico começa na parte inferior com o atributo da amostra medido diretamente por cada detector, em seguida, move-se para cima com os valores que são calculados diretamente a partir das respostas observadas dos detectores e termina na parte superior com informações computadas a partir dos dados calculados diretamente.

Os quatro detectores mais comumente associados a um sistema completo de GPC/SEC de múltiplos detectores são: um detector de índice de refração diferencial (RI), um detector de espalhamento de luz (RALS/LALS ou MALS), um detector de viscosímetro diferencial, e um detector UV. A característica específica de uma amostra à qual esses detectores respondem está listada na linha inferior da figura acima. O detector RI é responsivo à mudança no índice de refração entre a solução da amostra e o solvente de branco. O detector de espalhamento de luz responde mais fortemente ao peso molecular de uma amostra, com amostras de peso molecular mais elevado provocando uma resposta mais intensa. O sinal do detector de viscosímetro diferencial é baseado na diferença de viscosidade da solução da amostra em comparação com o solvente de branco. E a resposta do detector UV baseia-se no nível de absorvância da amostra. Uma amostra sem cromóforo que não absorve luz UV não produz sinal UV.

Todos os sistemas de GPC/SEC devem ter pelo menos um detector de concentração, independentemente de quais outros detectores estejam presentes. Os detectores RI e UV são considerados detectores de concentração porque suas respostas são diretamente proporcionais à concentração da amostra. A maioria dos sistemas utiliza um detector RI, pois nem todas as amostras são ativas em UV. Com o conhecimento do valor dn/dc de uma amostra, ou incremento do índice de refração, a concentração exata de uma amostra em cada fatia de dados pode ser calculada a partir do detector RI. Da mesma forma, ao usar um detector UV, o conhecimento do valor dA/dc da amostra, que está relacionado ao seu coeficiente de extinção molar, permitirá o cálculo da concentração da amostra em cada fatia de dados. Com ambos os detectores RI e UV, a composição de uma amostra composta de dois componentes pode ser determinada.

Conhecer a concentração exata da amostra em cada fatia de dados registrada é fundamental, pois é necessário para determinar o peso molecular e a viscosidade intrínseca, dois dos principais parâmetros moleculares incluídos na seção do meio do gráfico hierárquico anterior. Um exame das equações que regem as respostas dos detectores listadas acima revela por que a concentração da amostra é essencial. Se nos concentrarmos na equação de espalhamento de luz, a saída do detector é observada, o K_LS representa a constante do detector obtida pela análise de um padrão estreito, o peso molecular é desconhecido, o valor dn/dc é conhecido, pois é usado na equação para o detector RI para calcular a concentração, que é então inserida na equação de espalhamento de luz, e o volume de injeção é conhecido, já que é definido pelo usuário. Isso deixa o peso molecular como a única incógnita. Através da combinação dos detectores RI e de espalhamento de luz, o peso molecular de uma amostra pode ser calculado em cada fatia de dados. Os pesos moleculares calculados são então integrados sobre o pico definido da amostra e os momentos do peso molecular são calculados com base nas concentrações relativas de cada fração.

Um processo análogo ocorre com os detectores RI e de viscosímetro para calcular diretamente o IV da amostra em cada fatia de dados e produzir um valor de IV em média ponderada.

Partindo dos dados calculados diretamente no meio, o nível superior do gráfico hierárquico mostra que o peso molecular e o IV de uma amostra podem ser combinados para calcular indiretamente parâmetros que oferecem um insight sobre a estrutura molecular da amostra.

O tamanho de uma amostra é normalmente a segunda maior busca de dados de caracterização, após o peso molecular, e Rh é o parâmetro de tamanho mais adequado para todos os tipos de amostras. Deve-se notar que Rg pode ser calculado a partir de um detector de espalhamento de luz com pelo menos dois ângulos e um detector de concentração (daí sua colocação no nível médio), no entanto, a amostra precisa ser suficientemente grande para apresentar dependência angular. Muitas amostras, incluindo proteínas, não são grandes o suficiente para isso, e assim o Rg não pode ser calculado para essas amostras. Em contraste, Rh pode ser calculado desde que haja dados suficientes de um detector de concentração, um detector de espalhamento de luz e um detector de viscosímetro para produzir dados de peso molecular e IV. O Rh representa o raio da esfera teórica ocupada por uma amostra com o peso molecular e IV calculados. Como o IV é descrito em termos de dL/g, ou volume dividido por massa, ele pode ser combinado com o termo de massa de peso molecular para calcular um volume teórico para a amostra. Um modelo esférico baseado em (4/3)πr³ é aplicado para determinar r, que, em última análise, é o Rh da amostra.

Os parâmetros de Mark-Houwink (MH) são calculados a partir do gráfico MH, que mapeia o IV da amostra contra seu peso molecular para fornecer uma representação visual da relação entre os dois. Esses gráficos MH usam dados adquiridos por três detectores (concentração, espalhamento de luz e viscosímetro) e podem ilustrar mudanças na estrutura molecular dentro de uma única amostra ou destacar diferenças entre múltiplas amostras. Um uso frequente desses gráficos é identificar e quantificar a extensão da ramificação dentro da distribuição de uma amostra.

A análise de GPC/SEC de múltiplos detectores oferece uma variedade de dados de caracterização referentes a vários aspectos de uma amostra ao empregar uma série de detectores que medem diferentes parâmetros moleculares. Com um conjunto completo de detectores operando em conjunto, o resultado é uma coleção de dados que representa muito mais do que seria acessível para um sistema de detecção única. Através das medições diretas dos detectores individuais, certos parâmetros podem ser calculados diretamente. E a partir disso, o software pode obter ainda mais dados calculados indiretamente, culminando em informações que oferecem insights estruturais à amostra. Tudo isso a partir de uma única injeção da sua amostra!

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