Rh ou Rg: Qual é o melhor para minhas amostras de GPC/SEC?

O objetivo principal ao empregar cromatografia por permeação de gel / cromatografia de exclusão por tamanho (GPC/SEC) é geralmente determinar o peso molecular de uma amostra macromolecular. Sistemas com múltiplos detectores, como os sistemas OMNISEC e TDAmax da Malvern Panalytical, são capazes de oferecer uma gama de outros parâmetros de caracterização molecular, incluindo tamanho molecular. Em algumas situações, como a análise de proteínas ou outras amostras onde o peso molecular já é conhecido, o único propósito da análise é determinar o tamanho molecular da amostra. Nesses casos, o tamanho molecular pode revelar informações críticas sobre a estrutura molecular da amostra, o que geralmente está intimamente ligado à função ou aplicação final da amostra.

Existem duas medições comuns de tamanho molecular disponíveis através da análise de GPC/SEC: raio hidrodinâmico (Rh) e raio de giração (Rg). Um post anterior descreve como Rh e Rg são utilizados na caracterização de proteínas usando dispersão de luz dinâmica (DLS) e dispersão de raios X a pequenos ângulos (SAXS). Este post discutirá as definições de Rh e Rg, como os dois são calculados no contexto de GPC/SEC, e as implicações práticas dessas diferenças. Para mais detalhes (e mais equações!) sobre os tópicos aqui abordados, por favor veja estes documentos linkados.

Definições de Rh e Rg

Sem nos aprofundarmos muito na matemática (ainda), o Rh de uma amostra é o raio de uma esfera teórica que possui a mesma massa e densidade calculadas para a amostra a partir de seu peso molecular e viscosidade intrínseca. O Rg representa a distância quadrática média dos componentes da molécula a partir do centro de massa da molécula. Os números únicos de Rh e Rg gerados por uma análise de GPC/SEC são os valores médios ponderais obtidos a partir da compilação dos valores calculados em cada fatia de dados. Semelhante ao peso molecular médio ponderal (Mw), esses valores são os mais adequados para caracterizar a amostra como um todo. É importante notar que um detector de dispersão de luz com múltiplos ângulos (MALS) desacoplado de um instrumento de GPC/SEC, operando no modo de batelada, fornece o valor de Rgz, a média z de Rg.

Como Rh e Rg são calculados

Agora, vamos nos aprofundar um pouco na matemática. Com base no modelo de Einstein que descreve a viscosidade de uma solução de partículas esféricas, a relação entre Rh, peso molecular (M) e viscosidade intrínseca ([η]) é mostrada abaixo (N_A é o número de Avogadro).Como a GPC/SEC calcula diretamente o peso molecular e a viscosidade intrínseca em cada fatia de dados, o Rh pode ser facilmente determinado usando esta equação. Portanto, o limite inferior de cálculo de Rh alinha-se com a menor fração de amostra para a qual há resposta suficiente do detector nos canais de índice de refração (RI), dispersão de luz e viscosímetro.

Para calcular Rg a partir de GPC/SEC, há duas opções. O método direto e mais comum é observar a mudança na intensidade da luz espalhada em relação ao ângulo de observação. Isso requer um detector de dispersão de luz com pelo menos dois ângulos para observar a dependência angular da amostra.

Como mencionado na discussão anterior sobre Rh e Rg e em um post mais recente sobre detectores de dispersão de luz, é difícil determinar Rg para proteínas usando GPC/SEC, pois as proteínas são geralmente menores que 10-15 nm e, portanto, são dispersoras isotrópicas, ou seja, espalham luz igualmente em todas as direções. Polímeros de baixo peso molecular também são dispersores isotrópicos, o que significa que o gráfico de Zimm parcial resultante é plano, com inclinação zero, portanto Rg não pode ser determinado para esses materiais menores. Isto é representado na esquerda da Figura 1, acima.

Para que Rg seja calculado pela dispersão de luz, a molécula deve mostrar dependência angular, o que significa que a intensidade da luz espalhada varia com o ângulo de observação. Isso resulta em um gráfico de Zimm parcial inclinado, ilustrado pelo exemplo mostrado à direita na Figura 1. O comprimento de onda da luz usada no detector de dispersão de luz afeta o limiar de tamanho no qual uma amostra mostra dependência angular, portanto é possível que Rg possa ser calculado para faixas de tamanhos menores ajustando o comprimento de onda da fonte de luz.

Uma alternativa para calcular Rg é usando a equação de Flory-Fox, mostrada abaixo, que relaciona peso molecular (M) e viscosidade intrínseca ([η]) a Rg (Φ₀ é tratado como uma constante).A vantagem de calcular Rg desta maneira é que, como Rh acima, o limite inferior de cálculo depende da resposta do detector, em vez de a amostra mostrar dependência angular. A desvantagem é que o termo Φ₀ é realmente dependente da amostra, solvente e da estrutura molecular resultante sob estudo (é mais apropriado para bobinas aleatórias), e assim defini-lo como constante introduz um nível de aproximação. Em geral, e para o restante deste post, quando Rg é discutido, ele é calculado a partir de um detector de dispersão de luz.

Diferenças nos dados de Rh e Rg

Os dados de Rh e Rg disponíveis para uma determinada análise dependem da amostra específica em investigação. Já que o cálculo de Rg requer que uma molécula mostre dependência angular, se uma amostra for um dispersor isotrópico exibindo nenhuma dependência angular, há uma chance de que Rg não possa ser determinado. Uma amostra com uma distribuição ampla de peso molecular e tamanho molecular pode possuir grandes frações que mostram dependência angular e frações menores que não. Nesse caso, Rg só pode ser calculado para as moléculas maiores que eluem antes.

Um exemplo que destaca esse comportamento é mostrado na Figura 2. As porções dos dados nas quais os valores de Rh e Rg são calculados diretamente são representadas pelos segmentos sólidos dos gráficos verde escuro e magenta, respectivamente. As porções pontilhadas das linhas indicam regiões onde os valores de Rh e Rg são extrapolados. O menor valor de Rg que pode ser calculado para a amostra é 11,55 nm, o que representa o ponto em que as frações mais tardias da amostra são pequenas demais para mostrar dependência angular. Isso deixa Rg para ser extrapolado por uma grande seção da amostra. Em contraste, Rh pode ser calculado até 5,08 nm, permitindo que o tamanho molecular da maioria da amostra seja calculado diretamente.

Como Rh e Rg representam propriedades distintas da amostra, não se deve esperar que os valores resultantes sejam os mesmos. Isso não significa que um deles está errado! Para um determinado tipo de amostra e solvente, provavelmente haverá uma relação consistente entre os dois. Na minha experiência com amostras poliméricas (uma vez que é difícil obter dados de Rg para proteínas), o Rg calculado está na mesma ordem, mas um pouco maior que o Rh determinado (no exemplo da Figura 2, Rh = 13,62 nm; Rg = 14,19 nm). Isso não precisa ser verdade em todos os casos, pois a relação entre Rh e Rg depende da estrutura molecular.

O tamanho molecular é importante para cientistas por várias razões. Eu encorajo você a usar os dados disponíveis da maneira mais apropriada para suas amostras. E da próxima vez que você apresentar dados de GPC/SEC e alguém perguntar sobre as diferenças entre Rh e Rg, você estará pronto!

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