Como escolher entre Fluorimetria de Varredura Diferencial (DSF) e Calorimetria de Varredura Diferencial (DSC) em pesquisa biofarmacêutica

A estabilidade das proteínas é um parâmetro crítico na pesquisa biofarmacêutica. Nos últimos anos, a Fluorimetria de Varredura Diferencial (DSF) foi adicionada às caixas de ferramentas biofísicas de empresas farmacêuticas e utilizada para caracterização do desdobramento proteico. No entanto, com o aumento do número de novas modalidades de medicamentos entrando nas pipelines de desenvolvimento, vem a constatação da falta de versatilidade da tecnologia DSF. À medida que a pesquisa farmacêutica está cada vez mais priorizando biomoléculas, como conjugados de anticorpos, bispecíficos, nucleotídeos e nanopartículas lipídicas de mRNA, a DSF está ficando para trás.

Entra em cena a Calorimetria de Varredura Diferencial (DSC). A DSC é uma técnica multimodal com uma ampla gama de aplicações além de medir a estabilidade térmica das proteínas. Além disso, ela fornece uma imagem mais completa do que a DSF ao medir a termostabilidade das proteínas, o que pode melhorar a tomada de decisões e reduzir a probabilidade de falsos positivos.

Como funciona a Fluorimetria de Varredura Diferencial (DSF)?

A Fluorimetria de Varredura Diferencial (DSF) é um método baseado em fluorescência que mede a estabilidade das proteínas detectando mudanças na fluorescência à medida que uma proteína se desdobra. À medida que a temperatura aumenta, um corante fluorescente “marca” regiões hidrofóbicas expostas da proteína, gerando um sinal indicativo de eventos de desdobramento.

Isso significa que a DSF é limitada a proteínas com fluoróforos intrínsecos ou aquelas que podem ser marcadas. Co-solutos, incluindo o corante adicionado à amostra, também podem interferir nos sinais de fluorescência, reduzindo a confiabilidade. E apenas detecta eventos de desdobramento – não fornece dados sobre outros parâmetros termodinâmicos, como mudanças de entalpia.

Quais são as vantagens da Calorimetria de Varredura Diferencial?

A Calorimetria de Varredura Diferencial (DSC) mede diretamente o calor absorvido ou liberado durante o desdobramento das proteínas sem a necessidade de corantes fluorescentes. Ela fornece um perfil termodinâmico completo que inclui a temperatura de desdobramento (Tm) – o único parâmetro fornecido pela DSF – bem como mudanças de entalpia (ΔH) e capacidade calorífica (Cp).

A exclusão de corantes fluorescentes torna a DSC aplicável a proteínas, ácidos nucleicos, lipídios e suas montagens. Além disso, como a DSC não depende de medições ópticas baseadas em sinal, está livre de artefatos causados por quenching, agregação de proteínas ou dispersão de luz.

A repetibilidade e a confiabilidade da DSF não são superadas pela DSC, que é uma técnica mais versátil. Como resultado, os instrumentos DSC são um investimento altamente econômico e à prova de futuro.

DSF vs. DSC para medições de estabilidade proteica

A DSF oferece a vantagem de triagem de alto rendimento e requer volumes menores de amostra, tornando-se uma escolha prática para estudos em estágio inicial onde a velocidade e a eficiência são prioritárias. No entanto, é limitada por sua dependência de medições baseadas em fluorescência, o que pode introduzir variabilidade e limitar sua aplicabilidade.

Em contraste, a DSC fornece dados termodinâmicos abrangentes e altamente reprodutíveis, tornando-se essencial para o desenvolvimento de formulações biológicas, avaliação de biossimilaridade e submissões regulatórias. Ela não é afetada por artefatos ópticos e pode ser usada com uma ampla gama de tampões e co-solventes, garantindo resultados consistentes e confiáveis.

Em última análise, a escolha entre DSF e DSC depende dos requisitos específicos da aplicação. Se triagem rápida e consumo mínimo de amostra são necessários, a DSF pode ser a técnica preferida. No entanto, se é necessária uma visão termodinâmica precisa, reprodutível e detalhada, a DSC continua sendo o método superior.

Para o desenvolvimento biofarmacêutico, onde a caracterização da estabilidade influencia decisões de formulação e aprovação regulatória, a DSC continua sendo o padrão ouro. Com sua precisão e confiabilidade, o MicroCal PEAQ-DSC é uma ferramenta incomparável para pesquisadores que buscam a abordagem mais abrangente para a análise de estabilidade proteica.

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Leitura adicional

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