O Caminho para se Tornar um Mestre em Calorimetria Vol.1 (Continuação) O que é um Microcalorímetro?
Nakamura: “Os materiais do seminário apresentam uma visão geral e exemplos de medições de ITC e DSC resumidamente. Entendi mais ou menos que tipo de dados são obtidos e que informações podem ser deduzidas deles. No entanto, não parece haver explicações sobre como as medições são realmente feitas… Vamos investigar o ITC primeiro. iTC200…”
Este é o MicroCal iTC200 da Malvern…
Site do MicroCal iTC200
※O iTC200 foi descontinuado em 31 de março de 2017.
Por favor, consulte o PEAQ-ITC, atualmente à venda.
Aí está um vídeo também. Parece que, quando a amostra reage dentro da célula de amostra e gera calor, uma diferença de temperatura é criada em relação à célula de referência, a qual é controlada para eliminar essa diferença… é isso. Aparentemente, o sinal indica uma descida quando há liberação de calor, para diminuir a temperatura da célula de amostra. Agora entendi. Mas isso parece muito suscetível a influências do ambiente externo. Será que o sistema de ar condicionado não é um problema?
Parece que há uma explicação dos princípios também.
Esses são os dados frequentemente vistos em artigos. Mas por que é possível determinar constantes de dissociação a partir desses dados? Será que o KD é determinado por uma tangente?
ΔH, a entalpia, significa a quantidade de mudança no eixo vertical, certo? Hm? A unidade do eixo vertical mudou. Agora representa a mudança de calor por mol de amostra titulada.
Será que há uma explicação mais detalhada na página técnica?
Vou dar uma olhada.
Página de tecnologia de calorimetria de titulação isotérmica
“Finalmente, cada pico é integrado e plotado em relação à razão molar de ligante para proteína. O resultado é uma curva de titulação isotérmica que se ajusta ao modelo de ligação que fornece a afinidade (KD).” Então, não é que a constante de dissociação é determinada por uma tangente, mas sim que ela é ajustada por uma fórmula teórica.
“A razão molar no ponto médio da curva de titulação isotérmica determina a razão de ligação”. Mas, isso significa quantos sítios de ligação existem na amostra do lado da célula, certo? Por que a razão de ligação pode ser determinada pela razão molar no ponto médio?
A mudança de entalpia era a mudança no eixo vertical, mas aqui está escrito “Mecanismo de Ligação”. Por que a entalpia é vista como um mecanismo? Além disso, a entropia não aparece!
Hm, não entendo…
Mas parece que a preparação da amostra é fácil já que não requer rotulagem ou imobilização. “Quando o ligante se liga à proteína, ocorre uma mudança de temperatura de um milionésimo de grau”, diz, mas esse é um dispositivo que detecta tamanha mudança minúscula de temperatura. Bem, seria um problema se uma mudança ocorresse no corpo que alterasse a temperatura corporal ao ponto de uma ligação.
Em que áreas o ITC é útil…?
“O ITC é amplamente utilizado em descoberta e desenvolvimento de medicamentos para os seguintes propósitos:”.
“Quantificação da afinidade de ligação”, ou seja, parâmetros que normalmente são determinados por ELISA, RI, SPR, etc. A vantagem aqui é não haver imobilização, rotulagem ou lavagem para obter uma reação em um estado mais natural?
“Seleção e otimização de compostos candidatos”, quer dizer, triagem pela força de ligação?
“Medição de termodinâmica e concentração ativa”, dizem que os parâmetros termodinâmicos são informações úteis durante a análise estrutural, mas o que mede a concentração ativa? Será que é a “qualidade do controle de proteínas” mencionada nas informações do Interphex?
“Avaliação das características do mecanismo de ação” – bem, não entendo muito bem. Algo relacionado ao mecanismo de ligação?
“Confirmação do alvo de ligação em descoberta de fármacos de pequenas moléculas” – triagem. Contudo, o rendimento não parece ser muito alto…
“Compreensão da especificidade e da razão de ligação” – como distinguir o que não é específico?
“Validação de IC50 e EC50 em ‘hit to lead'” – isso talvez se refira à otimização após a triagem?
“Medição da velocidade de reação enzimática” – Enzimas!? Isso pode ser medido?
Aliás, não sei realmente como se faz a medição. Será que não existem manuais ou algo que eu possa baixar?
Vou contatar o fabricante para mais informações.”
Assim, Nakamura parece estar bastante envolvido com microcalorimetria.
Ele está tentando fazer sozinho, mas continua encontrando problemas que não pode resolver apenas com informações de sites ou manuais.
A partir de agora, traremos a história de Nakamura enquanto ele tenta se tornar um mestre em calorimetria quase todos os meses.
Planejamos incluir Q&A e solução de problemas que serão úteis para praticantes de calorimetria em nível inicial a intermediário.
Fique atento!!
Também estão disponíveis documentos técnicos relacionados. Baixe-os e aproveite.
Após preencher o formulário, você poderá baixar os seguintes materiais.
Notas de Aplicação ITC
Notas de Aplicação DSC
- Investigação da estabilidade da região Fab de anticorpos para desenvolvimento de biofármacos através de DSCs
- Calorimetria diferencial de varredura como ferramenta para desenvolver processos biofarmacêuticos rápidos e eficientes
- Aceleração do desenvolvimento de formulações líquidas biofarmacêuticas usando calorimetria diferencial de varredura
- Estudos de pré-formulação e estabilidade de biofármacos usando calorimetria diferencial de varredura
Apresentação do Professor Harumi Fukada
Pesquisador Visitante da Universidade da Prefeitura de Osaka
【Carreira】
Graduado em 1974 pelo Departamento de Química Agrícola da Universidade da Prefeitura de Osaka
Concluiu Os Créditos do Curso de Mestrado em Ciências Agrícolas em 1979
Assistente no Departamento de Agricultura da Universidade da Prefeitura de Osaka no mesmo ano
Professor Associado no Departamento de Agricultura da Universidade da Prefeitura de Osaka em 1997
Professor Associado na Escola de Ciências da Vida e Meio Ambiente da Universidade da Prefeitura de Osaka em 2008
Aposentado em 2015
Pós-escrito do Blog
O Professor Fukada esteve envolvido na construção de sistemas de calorimetria sob a orientação do Professor Takada Katsumasa, na época assistente no Departamento de Agricultura da Universidade da Prefeitura de Osaka, quando a calorimetria bioquímica estava começando a se desenvolver no Japão. Nas fases iniciais, eram usados calorímetros em frascos Dewar ou de fluxo, consumindo dezenas de miligramas de proteína por medição. Além disso, o laboratório do professor foi o primeiro no Japão a medir proteínas por calorimetria do ponto de vista bioquímico. Ele é um dos pioneiros no uso de uma ampla gama de equipamentos de medição de calor, incluindo o primeiro DSC desenvolvido no mundo por Privalov para soluções de proteínas. O Professor Takada ainda continua a pesquisa, no atual Kinki Science City, como parte de um contrato com o JST, medindo o calor gerado por microrganismos, e desenvolvendo novos “dispositivos de medição de atividade biológica”.
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