Triagem de misturas de reação bruta

Introdução

A triagem de fragmentos surgiu como uma abordagem poderosa para identificar compostos hit iniciais no processo de descoberta de medicamentos. A característica central é que um pequeno número (1000s) de compostos de baixo peso molecular (tipicamente <250 Da) é submetido à triagem para ligação a um alvo. O tamanho pequeno dos compostos significa que eles têm maior probabilidade de se ligarem, mas com afinidade fraca, e muitas abordagens biofísicas diferentes podem ser usadas, incluindo sensores da Creoptix. É relativamente simples identificar fragmentos que se ligam à maioria dos locais vinculativos na maioria dos alvos. O desafio é aumentar os fragmentos para compostos hit maiores com maior afinidade antes de começar a otimizar as propriedades do medicamento.

A afinidade por um composto (analito, A) que se liga a um alvo (ligante, L) assume um equilíbrio simples como:

em que k_d é a dissociação ou a taxa de dissociação e k_a, a associação ou a taxa de ativação e a constante ou afinidade de dissociação de equilíbrio (K_D) é a relação k_d/k_a. Em muitos casos, as melhorias na afinidade ocorrem quando as modificações no composto resultam em uma taxa de dissociação mais lenta. Esta é uma constante de taxa de primeira ordem e, portanto, é independente da concentração.

As abordagens convencionais à otimização exigem reações individuais para sintetizar cada composto, seguidas pela purificação e composição do composto em uma concentração definida antes de medir a afinidade em um ensaio. A Vernalis foi pioneira em uma abordagem em que as misturas de reação bruta (CRM) são verificadas, o que melhora consideravelmente a velocidade e o custo da síntese para explorar oportunidades para melhorar a afinidade do composto. Para um composto hit, um conjunto de reações são realizadas em paralelo geralmente em um formato baseado em placa, alterando o(s) substituto(s) incorporado(s) no composto hit. Após um workup mínimo, as misturas de reação bruta resultantes são avaliadas individualmente para mudanças na taxa de dissociação ligar ao alvo, uma mudança na taxa de dissociação indica que foi obtido um composto de afinidade melhorada. A demonstração inicial dessa triagem de taxa de dissociação (ORS)¹ usou a tecnologia Biacore para demonstrar melhorias de eficiência em termos de materiais, descarte de resíduos associados e tempo. Além disso, mais compostos podem ser classificados rapidamente nos estágios iniciais de um projeto, quando o entendimento das relações estrutura-atividade (SAR) é potencialmente baixo.

A capacidade de detectar alterações de forma confiável na taxa de dissociação é essencial para essa abordagem. A tecnologia patenteada de Interferometria acoplada a grade (GCI) oferece sensibilidade superior em relação às tecnologias tradicionais, como Ressonância plasmônica de superfície (SPR), permitindo a determinação confiável de taxas de dissociação de até 10 s^-1. Além disso, os microfluidos sem entupimento do WAVE da Creoptix permitem uma ampla variedade de solventes, incluindo acetonitrilo e altas concentrações de DMSO, aumentando a gama de substâncias que podem ser usadas em misturas de reação bruta.

Nesta nota técnica, comparamos os resultados de ORS obtidos com o WAVE da Creoptix com os obtidos anteriormente por Vernalis com o instrumento Biacore, retrospectivamente, utilizando-se a mesma biblioteca de CRMs em relação a dois alvos, a Piruvato desidrogenase quinase 2 (aa16-407), doravante denominada PDHK2, e o domínio ATPase N-terminal da Proteína de choque térmico 90α (aa9–236), doravante denominada Hsp90. A Vernalis identificou previamente uma série de potentes inibidores para ambos os membros da família GHKL de ATPases.^2,3,4

Materiais e métodos

Taxa de dissociação da triagem de misturas de reação bruta (CRM). Oitenta e três (83) CRMs e um composto de controle purificado foram submetidos à triagem para suas taxas de dissociação no WAVEdelta. Um WAVEchip PCH-NTA foi carregado com cloreto de níquel antes da captura das proteínas-alvo. Em seguida, duas proteínas HSP90 com etiqueta de poli-histidina 6 e duas proteínas PDHK2 com etiqueta de poli-histidina 6 foram capturadas em cerca de 7000 pg/mm² nos canais 2 e 3, respectivamente. Os canais 1 e 4 foram carregados com níquel e utilizados como canais de referência. As CRMs foram injetadas a uma concentração de aproximadamente 20 μM em HBS-P + 1% de DMSO por 30 s a uma vazão constante de 250 μl/min. A dissociação foi permitida por 120 s. A determinação da taxa de dissociação foi realizada com o uso do software WAVEcontrol.

Cinética do composto purificado

Um WAVEchip PCH-NTA foi carregado com 0,5 mm de NiCl² antes da captura das proteínas. HSP90 e PDHK2 foram capturados no tampão HBS-P a uma densidade de cerca de 3500 pg/mm2. O VER235377 (composto purificado) foi injetado a 30 μl/min em HBS-P + 1% de DMSO em concentrações crescentes que variaram de 27,4 nM a 20 μm (7 concentrações, diluições triplas). A injeção foi permitida por 60 s antes de uma fase de dissociação de 60 segundos. Todas as análises de interação foram realizadas a 25 °C e os dados foram avaliados por meio do WAVEcontrol. Utilizou-se o modelo Langmuir 1:1 para ajuste de dados e para determinação dos parâmetros cinéticos.

Resultados

A Vernalis foi pioneira no uso de triagem de taxa de dissociação (ORS) para obter amostras cineticamente no espaço químico da substância ativa ao protótipo (hit-to-lead).¹ Sua experiência em quimioinformática, síntese de biblioteca de compostos e análise de Ressonância plasmônica de superfície (SPR), foi atraente para este estudo de referência e possibilitou a ORS de produtos de reação não purificados (CRM). A triagem de CRM identifica rapidamente compostos lead a partir de hits de fragmentos sem a purificação de bibliotecas de compostos ou o uso de estruturas proteicas. Um estudo comparativo de ORS foi realizado utilizando-se o WAVEdelta (baseado na tecnologia GCI) e o Biacore T200 (baseado na tecnologia SPR) para comparar e contrastar as duas tecnologias. Especificamente, os compostos selecionados foram medidos no WAVEdelta e comparados a uma biblioteca de CRM testada retrospectivamente (em um Biacore T200) da Vernalis. 

A Figura 1 mostra exemplos de determinação de taxa da dissociação de CRMs selecionadas. Em ambos os experimentos, os resultados obtidos da WAVEdelta da Creoptix estavam de acordo com os obtidos do Biacore T200. Para os compostos com taxas de dissociação superiores a 1s^-1, o WAVEdelta conseguiu resolver confiavelmente essas constantes de dissociação muito rápidas (k_dissociado).

Figura 1: tela da taxa de dissociação das CRMs selecionadas. As medições foram realizadas em um Biacore T200 (painel esquerdo) ou WAVEdelta da Creoptix (painel direito). Os dados da GCI reproduzem os dados da SPR e permitem uma determinação de taxa de dissociação precisa e mais confiável de interações mais rápidas do que 1s^-1

Este estudo de triagem da taxa de dissociação levou à identificação do mesmo hit seletivo PDHK2 que também foi caracterizado como composto purificado (VER235377) no WAVEdelta. Os parâmetros cinéticos e a afinidade de ligação foram semelhantes aos obtidos pelo Biacore T200 com base em SPR. A Figura 2 mostra os dados obtidos pela GCI (WAVEdelta da Creoptix, painéis direitos) e SPR (Biacore T200, painéis esquerdos). Por fim, identificamos o mesmo composto hit seletivo PDHK2 (VER235377).^2,4 Os dados cinéticos obtidos são mostrados na Tabela 1.

	kassociado (M-1.s-1)	kdissociado (s-1)	Rmáx (pg/mm2)	KD (nM)
HSP90 Biacore T200	1,92 x 105	0,130	24,1	679
HSP90 WAVEdelta	1,82x105	0,122	25,2	669
PDHK2 Biacore T200	6,10 x 105	0,116	18,3	191
PDHK2 WAVEdelta	3,16 x 105	0,052	14,5	166

Tabela 1: Dados cinéticos para composto purificado VER235377 sobre HSP90 e PDHK2

Figura 2: Dados de cinética de ligação do composto purificado VER235377. As medições foram realizadas em um Biacore T200 (painel esquerdo) ou WAVEdelta da Creoptix (painel direito). Foram obtidos dados comparáveis para as proteínas HSP90 e PDHK2

Em resumo, com o WAVE da Creoptix, conseguimos:

• Confirmar o que foi previamente relatado e medido com um hit de PDHK2 do Biacore T200^2,4
• Confirmar o mesmo hit seletivo de PDHK2 VER235377 e caracterizá-lo em sua forma totalmente purificada
• Confirmar a seletividade PDHK2 VER235377 em relação a HSP90
• Mostrar excelente resolução para compostos com taxas de dissociação bem acima de 1s^-1, destacando a capacidade do WAVE da Creoptix de resolver taxas de dissociação rápidas

Conclusão

O WAVE da Creoptix oferece dados cinéticos em excelente concordância com as medições do Biacore T200, como mostram os resultados obtidos para uma campanha de composto Vernalis medida retrospectivamente em relação a Piruvato desidrogenase quinase 2 (PDHK2) e a Proteína de choque térmico 90 (HSP90). Com alta sensibilidade, a capacidade de resolver interações extremamente rápidas, o WAVE da Creoptix melhora a triagem de compostos e a análise cinética de pequenas moléculas para acelerar o desenvolvimento de medicamentos e reduzir significativamente os custos associados à purificação de alvos e de compostos. O WAVE está, portanto, idealmente posicionado para filtrar bibliotecas de ligantes fracos que exibem taxas de dissociação muito rápidas, como pequenas moléculas, fragmentos, peptídeos etc. Combinados com uma tecnologia microfluídica sem entupimento que permite o estudo de misturas de reação cruas e não purificadas, o WAVE está revolucionando e acelerando o processo de descoberta de medicamentos.

Principais conclusões

Capture a taxa de dissociação rápida de compostos de ligação fraca em misturas de reação bruta com o WAVEsystem da Creoptix.

• Microfluidos sem obstruções compatíveis com misturas de reação bruta: ideais para triagem da taxa de dissociação e arquitetura de medicamentos à base de fragmentos
• Dados comparáveis com dados históricos de SPR: A tecnologia GCI fornece dados cinéticos semelhantes aos obtidos com instrumentação baseada em SPR
• Taxas de dissociação bem resolvidas acima de 1 s^-1: com transição rápida, o WAVEsystem mede as taxas de dissociação de até 10 s^-1

Excelente para:

• Triagem de taxa de dissociação de misturas brutas: pequenas moléculas, fragmentos e peptídeos
• Progressão rápida do hit (substância ativa) ao lead (protótipo)
• Otimização do lead (protótipo)

Referências

1. Murray, J.B. et al. 2014. Off-Rate Screening (ORS) By Surface Plasmon Resonance. An efficient method to kinetically sample hit to lead chemical space in unpurified reaction products. J. Med. Chem. 57, 2845-1850 doi: /10.1021/jm401848a
2. Brough, P.A. et al. 2017. Application of Off-Rate Screening in the Identification of Novel Pan-Isoform Inhibitors of Pyruvate Dehydrogenase Kinase.J. Med. Chem., 60, 6, 2271–2286. doi: 10.1021/acs.jmedchem.6b01478
3. Brough, P. A. et al. 2009. Combining hit identification strategies: fragment-based and in silico approaches to orally active 2-aminothieno[2,3-d]pyrimidine inhibitors of the Hsp90 molecular chaperone. J. Med. Chem. 52, 4794–4809 doi: 10.1021/jm900357y
4. Baker, L. M. et al. Rapid optimization of fragments and hits to lead compounds from screening of crude reaction mixtures. Commun Chem 3, 122 (2020).doi: 10.1038/s42004-020-00367-0

Agradecimentos

Agradecemos à Dra. Natalia Matassova (Vernalis), por realizar todos os experimentos, e ao Prof. Roderick Hubbard, por sua contribuição para esta nota técnica.