Fluorimetría de barrido diferencial (DSF)
Información rápida sobre la estabilidad de las proteínas, la formulación y las interacciones biomoleculares
Información rápida sobre la estabilidad de las proteínas, la formulación y las interacciones biomoleculares
La fluorimetría de barrido diferencial (DSF, del inglés “Differential Scanning Fluorimetry”) es una técnica biofísica rápida que se utiliza para evaluar la estabilidad conformacional de las proteínas mediante el seguimiento de los cambios en la fluorescencia mientras una muestra se somete a estrés térmico controlado. A medida que aumenta la temperatura, la energía térmica altera la estructura tridimensional nativa de la proteína, lo que expone las regiones internas que se habían ocultado previamente dentro de su núcleo hidrofóbico.
En la DSF extrínseca tradicional, este despliegue estructural se detecta mediante colorantes indicadores externos que se unirán a regiones hidrofóbicas recién expuestas. La DSF intrínseca sin marcado depende de la fluorescencia natural de los aminoácidos aromáticos, como el triptófano dentro de la proteína. A medida que la muestra se despliega, el aminoácido aromático pasa de un entorno no polar oculto a un entorno polar expuesto, lo que cambia el espectro de emisión de fluorescencia natural de la proteína.
La fluorimetría de barrido diferencial intrínseca depende del aminoácido triptófano, que absorbe la luz UV a 280 nm y emite fluorescencia entre 300 nm y 400 nm.
En una proteína nativa plegada, los residuos de triptófano suelen residir en el núcleo hidrofóbico y emitir luz al máximo alrededor de 330 nm. A medida que el estrés térmico obliga a la proteína a desplegarse, estos residuos enterrados se exponen al ambiente acuoso polar circundante, lo que provoca que el espectro de emisión se mueva hacia 350 nm.
Mediante el registro de la proporción de estas dos longitudes de onda de emisión (F350/F330) en una rampa de temperatura controlada, el sistema traza una curva de despliegue térmico sigmoidal. El análisis matemático de esta curva identifica el comienzo del despliegue (Ton) y la temperatura de fusión media (Tm), donde se ha desplegado el 50 % de la población de proteínas.
Debido a que una Tm más alta refleja una mayor resistencia a la desnaturalización inducida por calor, la DSF permite a los investigadores clasificar rápidamente las moléculas candidatas, analizar las condiciones del amortiguador y evaluar la estabilidad de candidatos en procesos de desarrollo de medicamentos.
Además, cuando se combina con métodos de dispersión de luz (tales como dispersión de luz estática o dispersión de luz dinámica), la DSF intrínseca ayuda a distinguir entre el despliegue conformacional y la acumulación física, lo que ofrece un perfil de estabilidad integral de una proteína en una solución.
La fluorimetría de barrido diferencial (DSF, del inglés “Differential Scanning Fluorimetry”) mide la estabilidad térmica de la proteína mediante el monitoreo de los cambios conformacionales a medida que aumenta la temperatura. La diferencia entre la DSF extrínseca e intrínseca es básicamente si se agrega o no un colorante indicador.
| Característica | DSF extrínseca | DSF intrínseca |
|---|---|---|
| Mecanismo | Utiliza un colorante fluorescente agregado (p. ej., naranja SYPRO) que se une a las regiones hidrofóbicas expuestas durante el despliegue. | Técnica sin etiquetas que hace seguimiento de los cambios en la fluorescencia nativa de los aminoácidos aromáticos (Trp/Tyr). |
| Preparación de muestras | Requiere incorporación y optimización del colorante. | Sin etiquetado; mide las proteínas en su amortiguador nativo. |
Limitaciones de la DSF extrínseca:
Limitaciones de la DSF intrínseca:
Evaluación biofísica de última generación a escala
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