Méthode de la barrière de diffusion – les détails pratiques

Comment effectuer une mesure du potentiel zêta avec la méthode de la barrière de diffusion ?

La méthode de la barrière de diffusion est particulièrement adaptée aux faibles volumes d’échantillons et aux tampons à forte force ionique. La méthode consiste à injecter soigneusement un « bouchon » de l’échantillon dans une cellule capillaire pliée qui ne contient pour le moment que le tampon. (Le tampon doit être le même tampon que celui de la préparation des protéines, même conductivité, même pH, mêmes additifs, afin d’assortir l’échantillon et la barrière de diffusion aussi étroitement que possible). Dans ce montage, le potentiel zêta est principalement d’intérêt, cependant la taille peut également être déterminée.

Les détails pratiques sont discutés dans « La technique de la barrière de diffusion, aspects pratiques et interprétation des données », la présentation en ligne enregistrement « Mesures du potentiel zêta des protéines utilisant la nouvelle méthode de la barrière de diffusion de Malvern » ainsi que la note d’application « La technique de la barrière de diffusion pour des mesures précises et reproductibles de la mobilité des protéines« .  Voici ci-dessous un bref résumé de la vue d’ensemble pratique des principaux composants de cette méthode.

Pourquoi considérer cette méthode de barrière de diffusion ?

Il y a deux principales raisons pour lesquelles vous pourriez vouloir envisager cette méthode. Les deux sont dues à l’échantillon.

1. Disponibilité faible de l’échantillon. Si vous avez seulement une quantité très limitée d’échantillon, alors cette méthode permet une mesure même si seulement une partie de la cellule contient l’échantillon.  (Et le reste de la cellule contient du tampon).
2. Protection de l’échantillon contre les interactions avec les électrodes. Dans certaines conditions (par exemple forte force ionique, certains sels de phosphate, composants tampon contenant du soufre) le noircissement des électrodes (dégradation) peut se produire. Bien que le noircissement en soi ne soit pas nécessairement mauvais, il est une indication des interactions potentielles entre l’échantillon et l’électrode.

D’autres effets sont le chauffage Joule, la dégradation de l’échantillon (agrégation), et la polarisation de l’électrode. L’utilisation de la méthode de la barrière de diffusion peut aider à minimiser ces effets indésirables.

Comment introduire l’échantillon ?

L’échantillon est délicatement injecté dans la cellule capillaire DTS1070 remplie de tampon avec une pointe de charge de gel. Nous avons testé les pointes de pipette Costar (1-200µl, rondes, 0,5 mm d’épaisseur, Sigma cat:4853) et des pointes similaires devraient bien fonctionner. Pour leur utilisation, poussez délicatement la pointe de charge de gel à travers l’un des ports de chargement de la cellule capillaire jusqu’à ce que vous ressentiez une fin “naturelle”, puis injectez d’abord 70µl (vous ne vous tromperez jamais avec l’emplacement du bouchon dans ce cas). À mesure que vous vous familiariserez avec la méthode, il sera facile de réduire le volume d’injection à 50µl, puis finalement même jusqu’à 20µl. Vous pouvez vous entraîner avec soit une solution de dextran bleu, soit en utilisant le moniteur de taux de comptage dans le logiciel (Outils – Compteur de taux de comptage) pour confirmer que le volume de diffusion est dans le bouchon d’échantillon.

Quels paramètres dans le logiciel ?

Vous devez sélectionner des paramètres spéciaux de l’instrument pour pouvoir mesurer le potentiel zêta d’échantillons de protéines dans des tampons avec des forces ioniques relativement élevées. Le mode automatique dans le logiciel d’analyse zêta réduira la tension appliquée. Mais pour le traitement le plus doux de l’échantillon délicat, vous pouvez ajuster manuellement les paramètres d’analyse en fonction du tableau ci-dessous, extrait de la note d’application.

Pour accéder aux paramètres lors de la configuration manuelle ou SOP, allez à :

• Mesure -> Durée de la mesure -> Automatique -> Nombre maximum de séries
  Laisser le minimum à 10 et sélectionner le maximum selon le tableau
• Mesure -> Mesures -> Délai entre les mesures (sec)
  Lors de mesures répétées, il est bon de laisser reposer l’échantillon pendant 30 secondes
• Mesure -> Avancé -> Tension -> Sélection automatique de la tension -> Non
  Entrer la tension suggérée selon le tableau

Précédemment

• Obtenez le dernier logiciel Zetasizer DTS (téléchargement gratuit)
• Titrations complexes – dosage variable (zêta et taille)
• Conseils et astuces pour la caractérisation des nanoparticules (44 questions et réponses)
• Blog de lancement initial sur la méthode de la barrière de diffusion

Si vous avez des questions, veuillez m’envoyer un email à ulf.nobbmann@malvern.com. Merci ! Les opinions sont généralement celles de l’auteur. Cependant, notre équipe éditoriale peut avoir modifié certaines parties.