La voie du maître du calorimètre Vol.4
Développez vos compétences pour optimiser les expériences ITC !
Les personnages et l’histoire présentés ici sont fictifs.
Pour les aspects techniques, nous avons reçu les conseils du professeur Fukada, chercheur invité à l’Université Préfectorale d’Osaka.
※À la fin de cet article, vous pourrez télécharger des documents.
【L’histoire jusqu’à présent】
M. Nakamura de Maruban Pharmaceuticals a été chargé par son supérieur, M. Tanaka, de mettre en place un calorimètre. Sous la supervision du professeur Fukada, il a acquis les bases des mesures et de l’analyse de l’iTC200.
【L’histoire d’aujourd’hui】
Ayant acquis des compétences de base, M. Nakamura a décidé de commencer par une mesure d’anticorps-antigène qu’il avait sous la main. L’antigène est une protéine d’un poids moléculaire d’environ 50 kDa achetée, et l’anticorps est préparé par lui-même. L’affinité est estimée à environ quelques nM d’après d’autres résultats de mesure.
Apparemment, dans les articles, on met l’anticorps dans la cellule, et l’antigène dans la seringue la plupart du temps. Selon le calcul basé sur la valeur C(＊１), lorsqu’on a un KD de quelques nM, la concentration est trop faible, donc il fallait s’assurer au moins de 10 μM. Pour une liaison 1:1, on a besoin de 100 μM d’antigène, mais dans le cas des anticorps qui sont bivalents, on a donc besoin de 200 μM d’antigène. Hein ? Et si on mettait 5 μM d’anticorps et 100 μM d’antigène, ça marcherait aussi ? Comme je veux économiser des échantillons, essayons de faire la mesure à faible concentration. Commençons d’abord par une expérience de contrôle(＊２). En ce qui concerne le volume de goutte et le nombre de fois des ajouts, se référer aux conditions en page 9 du manuel simplifié en japonais, effectuer 18 ajouts de 2 µl chacun. Cependant, pour le premier ajout, appliquer 0,4 µl.
※1 Concernant la valeur C, elle est expliquée dans La voie du maître du calorimètre Vol.2.
※2 Pour l’expérience de contrôle, veuillez consulter La voie du maître du calorimètre Vol.3.
L’énergie de dilution semble grande, non? Ou c’est peut-être normal. Bon, mesurons l’échantillon alors.
Il n’y a presque pas de changement par rapport à l’expérience de contrôle?! Et même la chaleur dégagée en fin de mesure ne converge pas à zéro, bien que les tampons utilisés devraient avoir la même composition, donc une discordance de buffer semble improbable… La seringue serait-elle sale ? Non, non, avant la mesure j’avais fait un check système donc cela ne devrait pas être le cas. Professeur Fukada～.
M. Nakamura, que se passe-t-il ?
En fait, mon échantillon, l’antigène et l’anticorps, lorsque j’ai fait la mesure, il n’y avait presque aucune différence entre les deux ensembles de données.
Ah, effectivement. On ne sait même pas ce qui est mesuré avec ça. Avez-vous réfléchi à la cause ?
La DP est correcte avec la Reference Power réglée à 5 μcal/sec, donc ce n’est pas de la saleté dans la cellule, c’est sûr. Comme il y a un problème de réponse à la titration, j’ai aussi pensé que la seringue à titrer pourrait être sale, mais j’ai fait un check système avant la mesure et il n’y avait pas de problème. Donc je crois que c’est une discordance de buffer, mais j’utilise le même tampon pour préparer la concentration d’antigène, donc cela semble improbable.
Vous venez de dire : « J’utilise le même tampon. » N’avez-vous pas dialysé votre échantillon ?
Oui, cette fois, l’anticorps était préparé, mais l’antigène est acheté en Carrier Free. J’ai utilisé le même tampon que celui pour la purification par gel-filtration de l’anticorps pour préparer la concentration d’antigène.
Donc vous n’avez pas dialysé après la purification par gel-filtration. L’antigène a été préparé avec le tampon de gel-filtration ?
Pour être précis, j’ai utilisé un autre tampon préparé séparément pour ajuster la concentration d’antigène. Mais la composition devrait être la même.
M. Nakamura, il semble que, même si vous dites que la composition est la même, de légères différences peuvent survenir du fait de la pesée des réactifs, etc. Même si préparé le même jour, un léger changement peut se produire le jour suivant. De plus, vous avez utilisé Carrier Free et lyophilisé, n’est-ce pas ? Avez-vous vérifié sous quelles conditions la formulation a été réalisée ? Dans certains cas, des produits tels que le TFA ou l’acétonitrile peuvent avoir été utilisés, et ces substances peuvent affecter le pH, etc.
Quoi !? Vraiment !?
Pour aligner la composition de votre échantillon cellulaire et de la seringue, la dialyse est importante. En particulier pour les matériaux achetés, qui n’ont pas été préparés par vous-même, il est bon de dialyser avec l’anticorps pour éliminer les facteurs incertains.
Je comprends. Je vais refaire la mesure après dialyse. L’ITC est vraiment pointilleux …
Je précise. Aligner la composition de votre tampon cellulaire et de la seringue est crucial pour réaliser des mesures ITC. Si une grande réaction thermique et un changement sont observés dans des expériences de contrôle, cela peut indiquer un déséquilibre entre la solution de ligand et le tampon. Notez que si le méthanol utilisé pour sécher la seringue n’est pas suffisamment sec, ceci peut aussi être une source d’erreur.
Assurez-vous de vérifier l’adéquation des tampons avant d’avancer dans l’expérience. Si le problème persiste malgré une correspondance scrupuleuse des tampons, cela peut être dû à une agrégation ou une auto-association du ligand dans la seringue, et il convient de revoir les conditions de mesure.
Si votre ligand est une petite molécule non dialysable, préparez-le en dissolvant directement des ligands dans le dialysat de macromolécule, tout en prenant note des additifs restants ou des sels. Après dissolution, vérifiez le pH, et ajustez-le avec parcimonie au besoin.
N’oubliez pas que des différences mêmes infimes dans la concentration en sel peuvent être compensées lors de l’analyse de l’expérience de contrôle.
Pour les ligands à faible masse moléculaire comportant un groupe de désionisation protonique, notez que des tampons peu concentrés peuvent résulter en un manque de pouvoir tampon, ce qui peut aussi influencer le pH et les résultats expérientiels.
Le jour suivant ….
Dialyse terminée. Ajustement de concentration OK! Pas de déviation de pH. Installons l’échantillon pour la mesure !!
La chaleur dilutive de l’expérience de contrôle est constante. Les données montrent que la mesure d’échantillon convergent vers la chaleur dilutive en fin. La dialyse est vraiment essentielle ! Passons à l’analyse, maintenant
L’ajustement est bon ! KD est de 6 nM, et le ratio de liaison est de 1.8.
M. Nakamura. Vous avez obtenu de bonnes données.
Oui. J’ai réappris l’importance de la dialyse !
C’est bien. D’ailleurs, comment avez-vous soustrait les données de contrôle cette fois ?
J’ai soustrait les données brutes selon le manuel.
Exactement.
Je précise que dans le manuel, il est recommandé de soustraire les données brutes pour l’expérience de contrôle. Si la chaleur dilutive est constante, et si le bruit est important dans l’expérience de contrôle, soustraire la valeur moyenne peut être acceptable.
Maintenant, voici une question. Sur cette figure, les données résultent de la soustraction directe des données brutes de contrôle, mais il y a un problème pour l’analyse. Où se situe-t-il, selon vous ?
L’ajustement est mauvais ?
Oui, c’est cela. Mais pourquoi l’ajustement est-il mauvais ?
Est-ce que le modèle est erroné ?
Non, je ne pense pas que ce soit le modèle. Où trouvez-vous particulièrement que l’ajustement est mauvais ?
La portion plate vers la fin de la mesure ?
Oui, c’est ça. Pourquoi pensez-vous que c’est le cas ?
… Je ne sais pas.
Lors de l’ajustement, le logiciel de calcul cherche à faire en sorte que la chaleur vers la fin de la mesure converge vers zéro. Sur ce graphique, chaque point de données excède zéro, et pourtant, la ligne rouge de l’ajustement finit à zéro, n’est-ce pas ?
Ah, effectivement !
Donc M. Nakamura, comment se fait-il que la mesure ne conclue pas à zéro malgré la soustraction des contrôles ?
Y avait-il une différence de chaleur dilutive entre le contrôle et la mesure d’échantillon, avec plus de chaleur dans l’expérience de contrôle, créant ainsi une divergence ?
Oui, c’est cela. Que devrait-on faire dans ce cas ?
Hmm, je ne sais pas.
Parfois, quand la chaleur dilutive ne se soustrait pas correctement, on peut éditer les données pour ajuster la valeur post-courbe sigmoïde à zéro.
Y a-t-il une astuce pour cela ?
Y Translate est un outil que je recommande.
Y Translate ?
C’est littéralement un outil pour déplacer les valeurs le long de l’axe Y. Consultez les documents pour plus de détails.
Pour télécharger le document sur l’utilisation de Y Translate, veuillez remplir les informations requises dans le formulaire en bas de l’article.
Merci beaucoup.
On a besoin d’un bon niveau de familiarité avec le logiciel d’analyse… Il n’y a pas de manuel détaillé supplémentaire ?
Oui, il y en a un. Un fichier PDF peut être téléchargé depuis la page d’accueil (en anglais) de Malvern (inscription requise sur le site Malvern).
Les exemples d’analyse y sont expliqués en détails. Tous les données livrées sont sauvegardées sur le PC fourni.
Les formules de fitting utilisées pour l’analyse y sont également présentées, donc n’hésitez pas à vous en inspirer.
Y Translate terminé. Espérons que l’ajustement soit bon…
La différence entre les plots finaux et les données ajustées est réduite !
M. Nakamura, nous avons progressé dans notre apprentissage.
Oui !
Et M. Nakamura, quel buffer avez-vous choisi pour cette mesure ?
J’ai utilisé le tampon phosphate pour la préparation des anticorps, donc j’ai aussi utilisé un tampon phosphate pour l’ITC.
Bien. M. Nakamura, une question : si vous avez des buffers de même pH mais de composition différente, pensez-vous que vous obtiendriez les mêmes résultats ?
Euh!?
Par exemple, ici il s’agit d’un tampon phosphate, mais qu’arriverait-il si on utilisait un HEPES ou un Tris de même pH ?
Il est possible qu’il y ait des différences, comme on l’observe souvent en changeant de tampon dans des expériences…
Exactement. Le manuel simplifié en japonais contient un indice à ce sujet.
Vraiment ?
Regardez la section sur la composition des tampons à la page 5.
Ah, effectivement, il y a des différences d’enthalpie de protonation entre les tampons. Mais de combien ?
Les mesures semblent terminées, prenons une pause thé pour discuter (pour plus de détails, voir La colonne du Prof. Fukada 3).
Oui ! Merci Professeur Fukada !!
