시차 주사 열량측정법(DSC)은 안정성을 조사하기 위한 효율적인 도구로, 표지 또는 인공 프로브 없이 단백질 풀림을 연구할 수 있습니다. 단백질 접힘이 풀림에 따라 시료에서 흡수한 열을 확인하고 열 안정성을 측정합니다. 이 응용 노트에서 DSC로부터 얻은 열 안정성 데이터는 열 안정성으로 상관성을 설정하여 장기 보관 중 단백질 안정성을 예측하는 데 사용됩니다.
수명 기간 동안 단백질 치료제는 가공 및 보관 과정 전반에서 다양한 조건의 영향을 받습니다. 이는 보관 및 운송 과정의 낮은 pH, 다양한 완충액 성분 및 이온 강도, 온도 변동과 관련되어 있습니다. 또한 최종 제제는 높은 단백질 농도에서 수년간 안정적이어야 합니다. 환자에게 전달된 최종 약품은 네이티브 형태와 활성 상태로 유지되고 자가 결합과 응집은 최소화되어야 합니다. 이러한 조건이 단백질의 형태 및 자가 결합에 미치는 영향을 검사할 수 있는 분석 도구를 통해 개발할 바이오치료 후보 물질과 사용할 공정 및 처방 조건을 선택할 수 있습니다.
DSC는 서로 다른 완충액 조건(1-6)에서 단백질의 열 및 구조적 안정성을 평가하는 데 일반적으로 사용됩니다. 단백질 또는 개별 영역의 용융 온도는 DSC 프로파일로부터 얻을 수 있습니다(6). 반응이 가역적인 경우 단백질 풀림의 열역학적 매개 변수도 측정할 수 있습니다. 또한 풀림은 풀린 단백질의 응집과 침전에 따른 발열이 동반됩니다.
DSC는 항체 및 Fc 분절의 열적으로 유도된 풀림을 분석하는 데 사용되고 개별 영역의 전이를 식별합니다(6-9). 대개 CH2 영역이 처음 풀린 다음(7), Fab 및 CH3 영역이 풀립니다.
몇몇 대조 실험(그림 1)을 통해, PBS의 근접 생리적 조건 하에 71.0°C 및 83.1°C에서 Fc 분절의 CH2 및 CH3 영역이 각각 풀림을 알 수 있습니다. 단일클론 항체(MAb)의 Fab 영역에 대한 열 전이는 CH2 영역 및 CH3 영역 전이 사이에서 발생하거나 두 전이 중 하나와 중첩됩니다.
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SEC 또는 겔 여과(GF)는 안정성 지시 분석법으로 널리 사용되고 단백질이 노출되거나 보관 중인 상태에서 생성된 고분자량 종 및 단량체를 정량화할 수 있습니다.
여기에 설명된 작업에서는 동일한 완충액에서 DSC로 안정성을 예측하여 SEC-HPLC 분석으로 측정한 것과 같이 다른 온도와 조건에서 보관된 Fc 복합 단백질과 다른 항체의 안정성을 비교합니다. 이러한 결과는 DSC를 사용하여 장기 보관 중 단백질이 가장 안정적인 조건을 선택하고 장기 안정성에 대해 유사체와 같은 다른 단백질을 검사할 수 있음을 보여 줍니다.
별도로 기술되어 있지 않은 경우 시료는 표시된 pH에서 140mM NaCl과 20mM 구연산 나트륨을 이용하여 전처리했습니다. DSC 분석용 시료 및 HPLC 분석용 시료 등 각 단백질에 대해 동일한 시료 두 가지를 전처리했습니다. 모든 실험은 0.5mg/ml의 단백질 농도로 실시했습니다.
모든 시료의 기본 보관 온도는 4°C였습니다. 그러나 성공적인 단백질 치료제를 위해 장기 보관 수명을 반영하고, 이 온도에서 이 연구에 사용된 대부분의 단백질의 응집 변화를 관찰하려면 몇 달 혹은 몇 년이 걸릴 수 있습니다. 따라서 제한된 시간 내에(2개월) 이 프로젝트를 완료하기 위해 37°C를 보관 온도로 사용했습니다.
온라인 UV, 광 산란 및 굴절률 검출기(SEC-UV/LS/RI)가 있는 상업용 SEC-HPLC 시스템을 연구에 사용했습니다. Tosoh TSKgel™g3000SWXL(7.8 × 300mm) SEC 컬럼은 흐름 속도가 0.5 ml/min이고 시료는 표시된 시간에 주입했습니다. UV 크로마토그램은 280nm에서 모니터링했습니다.
DSC 실험은 Malvern MicroCal VP-DSC 시스템을 사용하여 실시했습니다. 모든 시료는 분석 전 5분 동안 가스를 제거했습니다. 기준 셀은 시료 완충액에 상응하는 완충액으로 채웠습니다. 시료는 60°C/h의 가열 속도로 4°C에서 110°C까지 가열했습니다. 사전 스캔 시간은 15분, 여과 시간은 10초였으며 피드백 모드/게인은 수동으로 설정했습니다. 열 전이 온도(Tm 또는 열 전이 온도)는 Origin™ 7 소프트웨어로 데이터를 분석하여 얻었습니다.
다른 pH 값의 Fc 복합 단백질 X에 대한 DSC 스캔은 그림 2에 나와 있습니다. 이 스캔의 열 전이 온도도 포함되어 있습니다. pH 7에서는 CH2 및 CH3 영역의 단백질 풀림에 상응하는 65.4°C 및 78.9°C의 두 가지 열 전이가 존재합니다. pH가 감소함에 따라 열 전이 온도가 감소하고 DSC로 예측한 안정성 순서는 pH 7 > pH 5 > pH 4입니다. 실제 단백질 안정성은 온라인 UV, 광 산란 및 굴절률 검출기가 있는 SEC-HPLC를 사용하여 연구했습니다. 광 산란 검출기를 사용할 때의 이점은 단량체 피크를 쉽게 확인할 수 있다는 것입니다(10). pH 7 및 pH 4에서 4°C로 보관된 Fc 복합 단백질 X의 SEC 크로마토그램은 그림 3과 그림 4에 각각 나와 있습니다. 4°C로 보관된 pH 7, pH 5 및 pH 4의 시료에 대해 다양한 시점에서 단량체 피크 비율을 비교한 것은 그림 5에 나와 있습니다. 이 응용 노트에서 SEC 단량체 데이터의 비율 값은 T = 0의 값을 기준으로 정규화됩니다.
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4°C에서 몇 주 이내에 pH 7 시료와 pH 5 시료의 안정성을 구분하는 것이 매우 어렵기 때문에 가속 연구는 37°C에서 실시했습니다. pH 7 및 pH 5 시료에 대해 다른 시점에서 SEC로부터 얻은 단량체 피크 비율에 대한 비교는 그림 6에 나와 있습니다. pH 7 및 pH 5에서 37°C로 보관된 Fc 복합 단백질 X의 안정성은 명확히 구분됩니다. 37°C에서 보관된 시료에 대해 단량체 피크 비율이 100% 이상으로 증가하는 것은 증발때문인데, 이는 37°C 시료에서 관찰되었고 모든 시료에서 단백질 농도가 증가되었습니다.
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이상의 두 가지 실험(4°C 및 37°C)에서 얻은 SEC 결과는 DSC 예측 사항을 확인하면서 Fc 복합 단백질 X의 실제 안정성 순서가 pH 7 > pH 5 > pH 4임을 분명하게 보여 줍니다.
pH 6 및 pH 5에 대한 Fc 복합 단백질 X의 DSC 스캔은 그림 7에 나와 있습니다. pH 6 및 pH 5에 대해 37°C로 보관한 후 다른 시점에서 SEC로부터 얻은 단량체 피크 비율의 비교는 그림 8에 나와 있습니다. 다시 한번 이 결과를 통해 DSC로 예측한 안정성 순서(pH 6 > pH 5)는 SEC에서 얻은 실제 안정성 데이터와 유사한 것을 알 수 있습니다.
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겉보기 열 안정성에 기여한 다른 한 요소는 풀린 단백질의 용해도입니다. Malvern MicroCal VP-DSC를 사용할 때 전이 후 최종 발열(음의 방향으로 급하강하는 곡선)은 풀린 단백질의 용해도를 반영합니다. 이는 단백질 안정성에 상당한 영향을 미칠 수 있는 전이 온도 이외의 또 다른 요소입니다.
응집/침전은 비가역 반응입니다. 이러한 반응이 발생하면 풀린 형태의 단백질에 유리하도록 풀림 반응의 가역 평형 상태가 달라집니다. 또한 풀린 중간 물질이 적게 용해될수록 많이 풀리게 되고 시간이 지남에 따라 응집이 발생합니다. 응집이 첫 번째 열 전이와 동시에 일어나는 경우 전체 반응 전에 발생하게 됩니다. 이로 인해 분석 작업이 더 복잡해 질 수 있습니다.
Fc 복합 단백질 X를 연구한 후 MAb에 동일한 방법과 절차를 사용합니다. 다른 pH 값에 대한 MAb Y의 DSC 스캔은 그림 9에 나와 있습니다. 열 전이 온도가 그림에 표시되어 있습니다. pH 7에서 열 전이가 한 번만 일어난 다음, 73.2°C에서 거의 즉시 응집 발열이 동반됩니다. pH가 감소하면 CH2 영역의 열 안정성이 감소하고 Tm 값은 pH 5와 pH 4 시료에 대해 각각 66.1°C와 47.9°C가 됩니다. DSC로 예측한 안정성 순서는 pH 7 > pH 5 > pH 4입니다.
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실제 단백질 안정성은 SEC-HPLC를 사용하여 다시 연구했습니다. 단량체 피크는 광 산란 검출 방법으로 확인했습니다(10). 4°C로 보관된 pH 7 및 pH 4 시료에 대해 다른 시점의 단량체 피크 비율을 비교했습니다(결과 표시되지 않음). 확장된 실험을 실시하여 수개월 동안 4°C로 보관하고 pH 7 및 pH 4에서 MAb Y 안정성을 구별하는 것이 가능하지 않으므로 가속 분해 연구를 37°C에서 수행했습니다.
37°C에서 보관한 pH 7, pH 5 및 pH 4 시료에 대해 SEC에서 얻은 단량체 피크 비율은 그림 10에 나와 있습니다. 결과를 통해 DSC로 예측한 안정성 순서를 확인할 수 있습니다(pH 7(약하게) > pH 5(현저히) > pH 4).
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앞에서 설명한 것과 같이 동일한 단백질에 대해 다른 값으로 열 안정성과 단백질 안정성 간의 상관성을 연구했습니다. 또한 동일한 접근법을 사용하여 동일한 완충액 조건에서 서로 다른 단백질의 안정성을 비교할 수 있는지 시험하고자 했습니다. 일반적으로 서로 다른 단백질을 비교할 때 단백질의 구조 유사성이 감소함에 따라 상대적 열 안정성과
상대적 장기 안정성 사이의 상관성이 감소합니다. DSC는 동일한 단백질의 유사체 검사를 포함하여 관련된 단백질의 안정성을 평가하는 데 사용했습니다.
pH 4, pH 5 및 pH 7에서 MAb Y 및 Fc 복합 단백질 X의 DSC 스캔으로부터 얻은 열 전이 온도의 비교는 그림 11에 나와 있습니다. pH 4, pH 5 및 pH 7에 대한 MAb Y 및 Fc 복합 단백질 X의 단량체 피크 비율 비교는 그림 12 ~ 14에 나와 있습니다. pH 4 및 pH 5에서 안정성 순서(MAb Y > Fc 복합 단백질 X)에 대한 DSC 예측은 SEC 안정성 데이터로 확인 가능합니다. pH 7 데이터는 더 복잡합니다. DSC 안정성 데이터를 통해 MAb Y가 Fc 복합 단백질 X보다 안정적이지만 SEC 데이터에서 차이가 분명하지 않음을 알 수 있습니다.
이러한 데이터가 도출된 데에는 몇 가지 이유가 있습니다. 한 가지 이유는 두 단백질이 pH 7에서 매우 안정적이고 SEC를 사용하여 단량체 양의 차이를 확인하려면 더 긴 보관 시간이 필요하기 때문입니다. 또 다른 이유는 풀린 Fc 복합 단백질 X가 MAb Y보다 용해가 잘되고(그림 2 및 9) 이로 인해 열 전이 온도차가 부분적으로 보정되며 두 단백질의 실제 안정성이 열 전이 온도만으로 예측한 것보다 더 유사하기 때문입니다. 이를 통해 응집 발열은 고려해야 할 주요 요소임을 알 수 있습니다.
이 기사에 설명된 접근법은 몇몇 다른 단백질, 항체 및 Fc 복합체를 연구하는 데 사용했습니다. DSC 데이터에서 얻은 열 안정성의 상대적 순서에는 SEC-HPLC 분석으로 확인된 다른 완충액에 있는 동일한 단백질의 실제 보관 안정성과 응집뿐만 아니라 다른 단백질의 실제 보관 안정성과 응집도 반영되었습니다.
특정 단백질의 보관 안정성과 열 안정성 간의 상관관계를 설정한 후 DSC를 사용하여 다른 돌연변이, 다른 구성물, Fc 관련 단백질 및 MAb를 신속하게 분석할 수 있습니다. 위에서 알 수 있듯이 풀린 단백질의 중간 물질 용해도와 단백질 구조의 유사점 및 차이점과 같은 기타 요소를 열 전이 온도 이외에 고려해야 합니다.
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DSC는 다른 pH 값에서 단일 클론 항체와 Fc 복합 단백질의 열 안정성을 연구하는 데 사용했습니다. SEC-HPLC는 상응하는 pH 값에서 동일한 단백질의 보관 안정성을 연구하는 데 사용했습니다. SEC-HPLC 안정성 데이터는 DSC로 예측한 안정성과 거의 일치하고 DSC에서 얻은 열 안정성 데이터는 낮은 온도에서 단백질 안정성과 상관되어 있음을 보여 줍니다. 또한 관련된 단백질의 상대적 열 안정성은 실제 장기 안정성의 차이를 반영합니다. 따라서 DSC는 낮은 온도의 단백질 안정성을 예측하고 완충액과 부형제를 검사하며 치료 후보 물질을 검사하고 단백질 응집을 예측하기에 유용한 도구입니다.
이 응용 노트는 Jie Wen, Yijia Jiang, Kathryn Hymes*, Kegong* 및 Linda Narhi(Amgen Inc., Thousand Oaks, CA)가 제공했습니다.
*하계 인턴사원
