Diffusion Barrier 방법 – 실용적인 세부사항

디퓨전 배리어 방법으로 제타 전위를 측정하는 방법은?

디퓨전 배리어 방법은 특히 낮은 샘플 양과 높은 이온 강도 버퍼에 적합합니다. 이 방법은 버퍼만을 포함하고 있는 접은 모세관 셀에 샘플의 “플러그”를 조심스럽게 주입하는 것으로 구성됩니다(버퍼는 단백질 준비의 버퍼와 동일해야 하며, 동일한 전도도, 동일한 pH, 동일한 첨가제가 포함되어 샘플과 디퓨전 배리어를 최대한 일치시켜야 합니다). 이 설정에서는 주로 제타 전위가 관심사이며, 크기도 결정할 수 있습니다.

실용적인 세부사항은 “디퓨전 배리어 기술, 실용적인 측면 및 데이터 해석” 및 웹 발표의 “Malvern의 새로운 디퓨전 배리어 방법을 사용한 단백질 제타 전위 측정” 녹음, 그리고 응용 노트 “정확하고 재현 가능한 단백질 이동성 측정을 위한 디퓨전 배리어 기술” 에서 논의됩니다. 아래에서 이 방법의 주요 요소들에 대한 실용적인 개요를 간단히 요약합니다.

디퓨전 배리어 방법을 고려하는 이유는?

이 방법을 고려하게 되는 주요 이유는 샘플 때문입니다.

1. 낮은 샘플 가용성. 만약 매우 적은 양의 샘플만 가지고 있다면, 이 방법은 셀의 일부만 샘플을 포함하고 있어도 측정할 수 있는 방법입니다. (나머지 셀은 버퍼가 차지합니다).
2. 샘플을 보호하기 위해 전극 상호작용에서. 일부 조건(예: 높은 이온 강도, 일부 인산염, 황을 포함한 버퍼 성분)에서는 전극이 검게 변할 수 있습니다. 검게 변하는 현상 자체가 반드시 나쁜 것은 아니지만, 샘플-전극 상호작용의 잠재적 가능성을 나타냅니다.

다른 영향으로는 쥴 열, 샘플 분해(응집), 전극 극화가 있습니다. 디퓨전 배리어 방법을 사용하면 이러한 부정적 영향을 최소화할 수 있습니다.

샘플 주입 방법은?

샘플은 젤 로딩 팁을 사용하여 버퍼로 채워진 DTS1070 모세관 셀 에 부드럽게 주입됩니다. 우리는 코스타 피펫 팁(1-200μl, 원형, 0.5mm 두께, 시그마 품목번호:4853)을 테스트하였으며 이와 유사한 것들도 잘 작동할 것입니다.  사용 시, 젤 로딩 팁을 모세관 셀의 로딩 포트 중 하나에 부드럽게 밀어 넣으면서 “자연스러운” 종지점을 느낄 때까지 밀어 70μl를 처음 주입하세요. (이 경우 슬러그 위치로 인해 실수가 없습니다). 방법에 익숙해지면 주입량을 50μl로, 나중에는 20μl로 줄일 수 있습니다. 이 방법을 블루 덱스트란 용액을 사용하거나, 소프트웨어의 카운트 레이트 모니터(Tools – Count Rate Meter)를 사용하여 샘플 슬러그 내에서 산란량이 있는지 확인하며 연습할 수 있습니다.

소프트웨어의 설정은?

상대적으로 높은 이온 강도를 가진 버퍼에서 단백질 샘플의 제타 전위를 측정할 수 있도록 특수한 도구 설정을 선택해야 합니다. 제타 분석 소프트웨어의 자동 모드는 적용 전압을 줄일 것입니다. 그러나 섬세한 샘플을 가장 부드럽게 다루기 위해, 응용 노트에서 가져온 아래 표에 따라 분석 설정을 수동으로 조정할 수 있습니다.

수동 또는 SOP 설정 중에 설정에 접근하려면 다음으로 이동하세요:

• 측정 -> 측정 기간 -> 자동 -> 최대 실행 횟수
  최소값을 10으로 유지하고 표에 맞게 최대값을 선택하세요
• 측정 -> 측정 -> 측정 간 지연 시간 (초)
  측정을 반복할 때, 샘플을 30초 동안 정지시키는 것이 좋습니다.
• 측정 -> 고급 -> 전압 -> 자동 전압 선택 -> 아니요
  표에 따라 제안된 전압을 입력하세요

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