단백질의 열적 언폴딩: 원리, 방법 및 응용 – 열적 언폴딩이란 무엇인가?

작성자 Agatha Rosenthal, Thursday, 3rd September 2026 AI 번역

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열적 언폴딩은 단백질의 고유한 3차원 구조가 온도에 의해 상실되는 현상입니다. 열에너지가 증가함에 따라 접힌 상태를 안정화하는 비공유결합 상호작용 — 수소 결합, 소수성 패킹, 반데르발스 접촉 — 이 점진적으로 붕괴되며, 단백질은 질서정연하고 조밀한 구조에서 무질서하거나 부분적으로 구조화된 상태로 전이합니다.

이 전이는 일반적으로 용융 온도(T_m)로 특징지어집니다. 이는 접힌 상태와 펼쳐진 상태의 집단이 동일한 비율로 존재하는 온도입니다. T_m는 단백질의 고립된 상태에서의 고정된 물리 상수가 아니라 용액 조건, 완충액 조성, 리간드나 부형제의 존재에 따라 달라집니다. 바로 이 점이 T_m를 유용하게 만듭니다. 조건이나 변이체 간의 T_m 비교는 상대적 열안정성을 정량적이고 재현 가능하게 측정할 수 있게 해줍니다. 이러한 조건 의존성은 시험관을 넘어 세포 전체 수준으로도 이어집니다. Leuenberger와 동료들의 세포 전체 열 프로파일링 연구는 온전한 세포 내부에서 수천 개의 단백질의 언폴딩을 동시에 추적했으며, 열안정성은 아미노산 서열만이 아니라 단백질 크기, 사차 구조, 응집 경향성과 같은 구조적·생물학적 특징들과 상관관계가 있음을 보여주었습니다.¹ 다시 말해 열안정성은 단백질의 접힘 자체만이 아니라 더 넓은 구조적 맥락을 반영하며, 이는 in vitro에서 관찰되는 Tm 변화가 기반 구조 민감성을 보여주는 매우 유용하고 일반화 가능한 지표인 이유를 뒷받침합니다.

더 높은 T_m는 일반적으로 더 열적으로 안정한 분자를 의미하며, T_m 변화는 돌연변이, 완충액, 부형제 또는 제형 조건이 단백질 안정성에 어떤 영향을 미치는지 가장 빠르게 확인하는 방법 중 하나입니다.

바이오의약품 개발에서 이것이 중요한 이유는 열안정성이 실제 스트레스 상황에서의 단백질 거동과 밀접하게 연관되기 때문입니다. 제조, 운송 또는 보관 중의 고온, 동결-해동 반복, 또는 유통기한 동안의 단순한 시간-온도 노출이 그것입니다. 낮거나 변동된 Tm은 분자가 이러한 스트레스에 더 취약할 수 있음을 보여주는 초기 지표입니다.

언폴딩은 또한 후속 위험과 기전적으로 연결되어 있습니다. 단백질이 고유 구조를 잃으면, 이전에는 내부에 묻혀 있던 소수성 잔기가 용매에 노출됩니다. 이러한 노출 표면은 단백질-단백질 결합의 주요 원인이므로, 부분적으로 또는 완전히 언폴딩된 종은 응집에 취약해집니다. 이어서 응집은 생물학적 활성 저하, 약동학 변화, 그리고 — 바이오의약품에서는 — 면역원성 위험과 연관됩니다. 따라서 열적 언폴딩은 그 자체로 중요한 것이 아니라, 이러한 후속 실패 양상에 앞서는 구조적 불안정성의 대리 지표입니다. 그래서 Llowarch 등은 열 이동(thermal shift)을 초기 약물 발견에서 단백질 안정성을 평가하는 가장 민감하고 널리 사용되는 판독값 중 하나로 설명합니다.²

열적 언폴딩은 어떻게 측정하나요?

차등 주사 열량계측(Differential scanning calorimetry, DSC)와 차등 주사 형광 분석(differential scanning fluorimetry, DSF)은 열적 언폴딩을 측정하는 데 가장 널리 사용되는 두 가지 기법이며, 본질적으로 서로 다른 물리적 특성을 탐지합니다.

DSC는 열을 직접 측정합니다. 언폴딩은 흡열 과정이므로 열용량 피크로 나타나며, 이로부터 리포터 분자나 가정된 분광 모델에 의존하지 않고도 T_m, 언폴딩 엔탈피(ΔH), 열용량 변화(ΔC_p)를 모두 추출할 수 있습니다. 따라서 DSC는 모델 독립적이고 열역학적으로 직접적인 측정법이며, 다른 방법을 검증할 때 기준이 되는 기술입니다.

DSF는 광학적이고 간접적입니다. 구조가 상실될 때 변하는 형광 신호를 추적합니다. 일반적인 DSF는 언폴딩 시 노출되는 소수성 표면에 결합하는 외인성 염료를 사용합니다. 완전한 무표지(label-free) 기법인 내인성 DSF는 단백질을 가열할 때 트립토판과 티로신 잔기의 고유 형광을 추적합니다. 언폴딩 중 이들 잔기가 용매에 더 많이 노출되면 방출 스펙트럼이 이동하고, 그 변화를 온도에 대해 나타내면 개시 온도와 T_m를 확인할 수 있습니다.

이 두 방법은 서로 대체 가능한 것이 아닙니다. NIST의 직접 비교에서는 DSC와 DSF의 T_m 값이 자주 일치하지만 항상 그런 것은 아니었습니다. 결과는 스캔 속도에 따라 달라지며, 방법 선택에 따라 얻어지는 전이 온도가 의미 있게 변할 수 있습니다. 이는 “무엇을 측정하느냐”만큼 “어떻게 측정하느냐”도 중요하다는 점을 상기시켜 줍니다.³ 언폴딩은 순수한 열역학적 조절이 아니라 동역학적으로 제어되는 경우가 많기 때문입니다.³

그래서 이 기술들은 대체물이 아니라 상호보완적입니다. DSC는 열역학적 깊이를 제공하고, DSF는 높은 처리량을 제공합니다. 초기 대규모 스크리닝에는 DSF를, 이후 도출된 후보를 확인하고 특성화하는 데는 DSC를 사용하는 방식은 각 기술의 주요 한계를 상쇄합니다. 이는 현재 약물 발견에서의 관행과도 부합합니다. 즉, 이동성 변화(shift) 분석은 1차 스크리닝으로, 열량 측정법은 직교적 확인법으로 사용됩니다.² DSC와 DSF는 구조 변화를 보고하지만, 단백질이 펼쳐지기 시작한 이후에 어떤 일이 일어나는지는 알려주지 않습니다. 동적 광산란(dynamic light scattering, DLS)은 이 간극을 메웁니다. DLS는 산란광의 변동을 분석해 용액 내 입자 크기를 측정하므로, 시료를 가열할 때 이합체, 올리고머, 더 큰 응집체와 같은 고차 종의 출현에 매우 민감합니다. DSF 또는 DSC와 함께 열 램프로 수행하면 DLS는 소수반경 변화와 함께 응집 개시 온도(T_agg)를 보여주어, 언폴딩 사건 이후 자가 결합이 뒤따르는지를 드러냅니다.

DLS와 SLS: 전체 그림 완성하기

정적 광산란(static light scattering, SLS)은 여기에 한층 더 열역학적인 층위를 더합니다. 산란 강도의 농도 의존성으로부터 SLS는 제2 비리얼 계수, B₂₂를 직접 제공합니다. 이는 순 단백질-단백질 상호작용의 척도입니다. 이는 일반적으로 DLS만으로 얻는 확산 상호작용 파라미터 k_D보다 더 엄밀한 판독값입니다. k_D는 경험적 값이며 실제 열역학적 상호작용에 수화 및 마찰 효과가 섞여 들어가, 때로는 관찰되는 상호작용의 부호를 왜곡하거나 심지어 뒤집을 수도 있습니다. 반면 B₂₂는 이러한 수력학적 인공물을 배제하므로, 콜로이드 안정성, 용해도, 응집 경향성을 더 직접적이고 신뢰성 있게 예측합니다.

구조 분석(DSF 또는 DSC), 크기 분석(DLS), 열역학적 상호작용 분석(SLS)을 함께 사용하면 하나의 열 스캔이 완전한 그림이 됩니다. 단백질이 언제 언폴딩되는지뿐 아니라, 언폴딩이 얼마나 강하게 일어나고 어떤 조건에서 자가 결합으로 이어지는지까지 보여줍니다.

왜 DSF와 고처리량 DLS/SLS를 결합해야 할까요?

언폴딩과 응집은 관련이 있지만 동일한 사건은 아니며, 항상 함께 진행되지는 않습니다. 분자는 구조적으로 매우 안정하더라도 콜로이드 불안정성 때문에 중간 온도에서 응집할 수 있습니다. 반대로, 비교적 낮은 T_m에서 언폴딩되더라도 즉시 눈에 보이는 응집체를 형성하지 않을 수 있습니다. 둘 중 하나만 측정하면 다른 실패 양상을 놓칠 위험이 있습니다.

이는 열 이동(thermal shift) 접근법에 관한 약물 발견 문헌에서 정확히 제기된 논점입니다. 이러한 분석은 온도와 단백질의 접힘/펼침 평형 사이의 단순한 물리적 연결에 기반하기 때문에, 그 평형이 실제로 시료에 무엇을 일으키는지 확인하는 직교 검출법과 함께 사용할 때 가장 유용합니다.⁴ 동일한 플레이트에서 동일한 열 램프로 DSF와 DLS/SLS를 수행하면, 각 T_m 값은 동일한 시료와 가열 프로파일에서 얻어진 T_agg 값과 대조할 수 있습니다. 두 번째 실험도, 별도 분취도 필요 없으며, 분석 간 차이가 실제로는 시료 준비 차이에 불과할 위험도 줄어듭니다.

과학적 이점만큼이나 효율성도 중요합니다. 별도로 DSC 캠페인, DSF 스크리닝, 그리고 DLS/SLS 안정성 연구를 수행하는 대신, 결합된 DSF/DLS/SLS 워크플로는 구조적 데이터와 콜로이드 데이터를 한 번에 수집합니다. 수십 개의 완충액, pH, 부형제 조합을 비교해야 하는 제형 스크리닝과 안정성 평가에서는, 이러한 통합이 데이터의 깊이와 품질을 유지하면서도 시료와 시간을 절약해 줍니다.

고처리량 분석의 장점

고처리량의 의미는 단순한 속도 그 이상입니다. 어떤 종류의 질문을 던질 수 있는지를 바꿉니다. 플레이트 기반의 고처리량 DSF/DLS/SLS 워크플로는 동일한 조건에서 수십 개의 제형, 완충액 또는 후보 분자를 하나의 런에서 나란히 비교할 수 있게 합니다.

이러한 폭은 개발 초기 단계에서 특히 중요합니다. 이 시기의 목표는 한 분자를 완전히 특성화하는 것이 아니라, 여러 후보를 비교하고 순위를 매기는 것이기 때문입니다. 이 단계에서 소수 조건에 대한 깊지만 제한적인 데이터보다, 견고하고 비교 가능한 데이터 세트를 생성하는 것이 제형 및 후보 선정 팀에 훨씬 더 강력한 의사결정 근거를 제공합니다. 더 빠른 스크리닝은 후보나 조건을 쫓아가며 시간을 낭비하지 않게 하고, 결정을 더 빨리 내릴 수 있게 합니다. 궁극적으로 이는 모든 바이오의약품 프로그램이 추구하는 것과 같습니다. 개발 기간을 단축하고, 물질과 장비 시간을 가장 중요한 곳에 쓰는 것입니다.

바이오의약품에서의 응용

제형 개발. 부형제, 완충액, pH, 이온 강도를 T_m 및 T_agg와 병렬로 스크리닝하면, 제형 개발자는 분자가 언폴딩과 응집 둘 다에 대해 보호받는 조건을 신속하게 찾을 수 있습니다. 둘 중 하나만이 아닙니다.

후보 스크리닝. 여러 후보 변이체나 돌연변이를 비교해야 할 때, 열안정성 프로파일링은 이를 가장 빠르게 순위화하는 방법 중 하나입니다. 이를 통해 이후 제조 가능성이나 안정성 문제를 일으킬 가능성이 가장 낮은 후보를 식별할 수 있습니다.

안정성 연구. 안정성 연구는 언폴딩과 응집 거동을 결합하여 열 스트레스 하에서 분자의 위험 프로파일을 구축합니다. 후보 제형이나 저장 조건 전반에 걸쳐 T_onset, T_m, T_agg, B₂₂를 추적하면, 단백질이 구조를 잃기 시작하는 지점뿐 아니라 그 구조 손실이 자가 결합으로 이어지는지도 보여줍니다. 이는 개발 후반에 응집 취약 조건이 드러나기 전에 이를 식별하는 데 필요한 조합입니다.

더 적은 노력으로 얻는 통합적 통찰. 이 세 가지 사용 사례 모두에서, 고처리량 내인성 DSF와 고처리량 DLS/SLS를 결합하는 장점은 같습니다. 더 적은 시료와 더 짧은 시간으로, 개별 기법을 따로 수행할 때보다 더 풍부하고 상관성이 높은 데이터를 얻을 수 있다는 점입니다.

결론

열적 언폴딩은 단백질 안정성을 파악하는 가장 정보량이 풍부한 방법 중 하나이지만, 전체 그림을 볼 때만 그렇습니다. 내인성 DSF와 고처리량 DLS를 결합하면 같은 시료, 같은 열 램프에서 구조 변화와 응집 거동을 나란히 포착할 수 있습니다. 실용적 이점은 분명합니다. 시료 사용량 감소, 제형 또는 후보 전반에 대한 더 빠른 스크리닝, 그리고 제형이나 분자 선정 의사결정의 근거가 되는 안정성 데이터에 대한 더 높은 신뢰입니다.

참고문헌

Leuenberger P, Ganscha S, Kahraman A, et al. Cell-wide analysis of protein thermal unfolding reveals determinants of thermostability. Science. 2017;355(6327):eaai7825. https://www.science.org/doi/10.1126/science.aai7825
Llowarch P, Usselmann L, Ivanov D, Holdgate GA. Thermal unfolding methods in drug discovery. Biophysics Reviews. 2023;4(2):021305. https://pmc.ncbi.nlm.nih.gov/articles/PMC10903397/
Lang BE, Cole KD. Measurement of the Thermal Unfolding of Proteins by Differential Scanning Calorimetry and Fluorescent Reporter Dyes. National Institute of Standards and Technology. https://www.nist.gov/publications/measurement-thermal-unfolding-proteins-differential-scanning-calorimetry-and
Thompson A. Employing thermal protein unfolding to search for new drugs. Scilight. 2023;2023(20):201108. https://pubs.aip.org/aip/sci/article/2023/20/201108/2890803/Employing-thermal-protein-unfolding-to-search-for

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