어떤 광산란 검출기가 나에게 가장 적합할까요?

젤 투과/크기 배제 크로마토그래피 (GPC/SEC) 시스템 중 어떤 것이 당신의 필요에 가장 적합한 시스템인지 결정하는 것은 상당히 어려운 일이 될 수 있습니다. 절대 분자량 데이터를 얻기 위해 광산란 검출기를 포함하기로 결정한 이후에도, 다각도 광산란 (MALS) 검출기와 직각 및 저각 광산란 검출기 (RALS/LALS) 중 하나를 선택해야 합니다. 두 광산란 구성 모두 샘플의 절대 분자량을 제공하지만, 그 공통 목표를 달성하기 위한 접근 방식은 다릅니다. 다행히도, Malvern Panalytical는 이 두 가지를 모두 제공합니다; SEC-MALS 20 모듈 유닛은 OMNISEC이나 TDAmax 또는 기타 타사 시스템에 연결할 수 있으며, 통합 RALS/LALS 검출기는 OMNISEC와 TDAmax 전체 GPC/SEC 시스템에 통합되어 있습니다. 이 글에서는 MALS 및 RALS/LALS 검출기에 대해 논의하고, 이러한 구성 중 어느 것이 여러분과 여러분의 응용에 가장 적합한지 결정할 수 있는 관련 정보를 제공하도록 하겠습니다.

먼저 한 걸음 물러나서 광산란 이론에 대해 간략히 논의하겠습니다 (정적인 광산란에 대한 자세한 논의는 이 주제에 대해 이전에 게시된 백서를 참조하십시오). 광산란 검출기가 작동하는 이유는 분자에 의해 산란된 광도의 강도가 분자량에 직접 비례하기 때문입니다. 분자량이 높을수록 산란광의 강도가 증가합니다. 이 관계는 아래에 표시된 레일리 방정식에 의해 강조되며, 여기서 RΘ는 특정 각도 Θ에서의 산란광의 강도를 나타내고 Mw는 샘플의 분자량입니다.

추가적으로, 산란된 광의 관찰 각도도 역할을 합니다. 반경이 10-15 nm이거나 그보다 작은 비교적 작은 샘플들은 모든 방향에서 동일하게 빛을 산란시키는 등방성 산란체로 알려져 있습니다. 즉, 90° 검출기에서 관찰된 광의 강도는 15°, 45°, 135° 등에 위치한 검출기에서 관찰된 광의 강도와 동일합니다. 10-15 nm 범위 이상의 큰 샘플은 샘플이 검출기에 도달하기 전에 여러 번 빛을 산란시키기 때문에 간섭의 영향을 받습니다. 그 결과, 큰 샘플의 경우 산란광의 강도는 관찰 각도에 따라 달라집니다. 산란광의 강도가 각도에 따라 달라진다는 것은 검출기의 배치에 따라 다양한 분자량이 계산될 수 있음을 의미합니다. 간섭의 영향을 최소화하기 위해서는 큰 샘플에서 최적의 산란광 강도 관찰 각도는 0° 각도입니다. 실용적인 관점에서 이는 불가능합니다. 왜냐하면 검출기는 샘플로부터의 산란광과 입사광의 빛을 구분할 수 없기 때문입니다. 문제를 해결하기 위해, MALS 및 RALS/LALS 검출기 구성에 의해 0° 각도에서의 산란광 강도 관찰이 이루어집니다.

MALS 검출기는 일반적으로 샘플 플로우 셀 주변에 다양한 각도로 배열된 최소 3개에서 최대 20개의 검출기를 사용합니다. 보통 90° 검출기가 포함되며, 나머지 검출기는 최소 12°에서 최대 168°까지 다양합니다. MALS 검출기는 다양한 각도에서 산란된 광을 측정하고, 데이터를 모델에 맞추어 0°까지 외삽을 통해 샘플의 분자량을 결정합니다. 샘플이 등방성 산란체인 경우, 각 데이터 포인트는 동일한 산란 강도를 나타내며 0°까지의 외삽은 플랫 라인이 됩니다. 샘플이 각도 의존성을 보일 만큼 큰 경우에는 관찰 각도에 따른 산란광 강도의 차이가 나타납니다. 두 예시는 아래의 부분 Zimm 플롯에서 볼 수 있습니다.

MALS 반응의 여러 각도를 보여주는 부분 Zimm 플롯. 좌측: 모든 각도에서 동일한 강도를 보이는 등방성 산란 샘플. 우측: 플롯의 기울기로 각도 의존성을 보여주는 샘플.

RALS/LALS 검출기 배열은 90° 및 7° 검출기로 구성되며, 이들은 상호 보완적인 특성 때문에 신중하게 선택된 것입니다. 반경이 10-15 nm 이하인 샘플의 경우, 90° 검출기가 입사빔의 직각에 위치하여 신호 대 잡음비를 최대화하므로 이상적입니다. 작은 샘플은 모든 방향으로 동일한 강도로 빛을 산란시키므로, RALS 검출기는 샘플의 분자량을 직접적으로 측정하는 데 이상적인 반응을 제공합니다. 반경이 10-15 nm 이상으로 각도 의존성을 나타내는 샘플의 경우, LALS 검출기는 7°에서 측정값을 제공하여 fitting 및 외삽의 필요성을 회피합니다. LALS 검출기는 모든 크기의 샘플에 대해 정확하지만, 작은 저분자량 샘플에서 제공되는 낮은 강도의 산란광 때문에, RALS는 입사광원과 직각으로 배치되어 더 깨끗한 신호를 제공합니다.

분자량의 직접 측정을 보여주는 부분 Zimm 플롯. 좌측: 등방성 산란을 보여주는 샘플의 90° RALS 반응. 우측: 각도 의존성을 보여주는 샘플의 7° LALS 반응.

자신의 요구에 가장 적합한 광산란 검출기를 결정하려면 여러분의 응용 분야, 찾고자 하는 정보, 그리고 개인적인 선호를 고려해야 합니다. MALS와 RALS/LALS 검출기는 각각의 장단점이 있어서 특정 상황에 더 잘 맞을 수 있으나, 다행히도 둘 다 정확한 결과를 제공합니다!

예를 들어, 주로 분석하고자 하는 샘플이 고분자량인 큰 샘플인 경우, MALS와 RALS/LALS 검출기 구성 모두 샘플 내의 모든 분자량 범위를 처리하도록 설계되어 있습니다. 그러나 작은 저분자량 재료의 분석에 주로 관심이 있는 경우 RALS 검출기가 대다수의 분석을 수행할 수 있습니다. 보완적인 LALS 검출기는 샘플 내의 농도가 낮더라도 큰 부분이나 잠재적 집합체가 정확하게 관찰되도록 합니다. MALS 검출기는 올바른 분자량을 결정할 수 있지만, 작고 등방성 산란 샘플의 경우 모든 검출기가 동일한 강도의 산란광을 관찰하므로 여러 번 동일한 결과를 얻는 것이 중복될 수 있습니다.

위의 예는 단백질을 연구하는 과학자들에게 종종 해당됩니다. 구조의 질서 정연한 특성으로 인해, 단백질은 상대적으로 밀도가 높은 분자로 구성됩니다. 이는 높은 분자량의 물질이라 하더라도 상대적으로 크기가 작다는 것을 의미합니다. 분자량이 700 kDa에 해당하는 단백질조차도 반지름이 10-12 nm에 불과합니다. 높은 분자량의 잠재력에도 불구하고 상대적으로 작은 분자 크기 때문에 단백질은 일반적으로 등방성 산란체로 여겨지며, RALS/LALS 검출기에 이상적인 샘플입니다. 이 경우 RALS 검출기는 주로 계산에 사용되고, LALS 검출기는 샘플의 집합체나 큰 구성 요소를 확인합니다. 단백질이 일반적으로 등방성 산란체인 경우, 다양한 각도에 위치한 많은 검출기가 포함된 MALS 검출기를 사용하는 것은 추가적인 이점이 없습니다.

이를 입증하기 위해, 여러 단백질의 분자량은 RALS와 MALS 검출기를 사용하여 측정되었습니다. 그 결과 데이터는 아래 도표에 제시되어 있으며, 두 검출기 모두 동일한 분자량을 얻었다는 것이 명확합니다. 이는 등방성 산란을 보이는 샘플에 대해 RALS 검출기가 MALS 검출기와 동일한 결과를 제공한다는 것을 확인합니다.

RALS 및 MALS 검출기로 계산된 단백질 분자량; 분자량 단위 kDa

만약 여러분이 분자량뿐만 아니라 분자 크기에도 관심이 있다면, MALS 검출기는 샘플의 회전반경(Rg)을 계산할 수 있는 기능을 제공합니다. 그러나 여기에는 주의할 점이 있습니다: 이는 반지름이 10-15 nm 이상인 샘플에서만 가능하며, Rg는 부분 Zimm 플롯의 각도 의존성에서 생성된 기울기로부터 계산됩니다. 샘플이 등방성 산란체인 경우 기울기가 없으며 Rg는 결정될 수 없습니다. 부가적으로, 수분반경(Rh)은 몇 nm까지의 샘플에 대해 점도계 검출기로부터 얻은 고유 점도(IV) 데이터와 광산란 검출기로부터 얻은 분자량 데이터를 결합하여 결정할 수 있습니다.

또한 특정 응용 분야에 맞춘 몇 가지 실용적인 항목을 고려할 필요가 있습니다. 예를 들어, 다수의 검출기를 통합하고 있다면 특히 UPLC 응용에 있어 RALS/LALS 검출기에 있는 작은 플로우 셀이 유리할 수 있습니다. 또는 광산란 셀의 오염 문제를 겪은 적이 있다면, 특정 셀 방향(예: SEC-MALS 20의 수직 플로우 셀)이 추가적인 견고성과 신뢰성을 제공할 수 있습니다.

물론, 개인적인 선호도는 광산란 검출기를 선택할 때 항상 요인입니다. 아마도 여러분은 항상 MALS 검출기를 사용해왔고 특정 외삽 모델을 사용하여 분자량을 계산하는 것에 더 편안할 수도 있습니다. 또는 아마도 RALS/LALS 접근법의 간결함과 직접성을 선호하여 분자량을 계산할 수도 있습니다. 또는 예산 내에서 작업하며 장비의 가치를 최대화하고 싶을 수도 있습니다.

이 마지막 항목에 대해 잠시 언급하고자 합니다. 이는 모두가 공감할 수 있는 것이기 때문입니다. 이러한 검출기 유닛의 비용은 포함된 개별 광산란 검출기 수에 따라 달라집니다. RALS/LALS 구성에는 두 개의 검출기가 있으며, SEC-MALS 20에는 스무 개의 검출기가 있습니다. 가격은 이에 따라 달라집니다. MALS 검출기에 있는 각도 범위를 가지는 것은 실질적인 단점이 없지만, 등방성 산란체에 관해 위에서 논의된 것처럼 추가적인 각도는 항상 추가적인 정보를 제공하지는 않습니다.

가장 비용 효율적인 방법은 아니지만, 동일한 시스템에 MALS와 RALS/LALS 검출기를 모두 가지고 데이터를 동시에 수집한 후, 데이터 분석 중 계산에 사용할 것을 결정할 수도 있습니다.

이 게시물에서 여러분이 MALS 또는 RALS/LALS 검출기(또는 둘 다)가 여러분의 응용에 맞는지 결정하는 데 필요한 충분한 정보를 제공할 수 있기를 바랍니다. 어떤 것을 선택하든, 우리는 여러분을 도울 준비가 되어 있습니다!

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