단백질과 저분자 리간드 간의 결합 상호작용을 측정하고 특성화하는 것은 신약 개발에 있어 근본적으로 중요한 과정이다. 이러한 결합 상호작용을 정밀하게 특성화하는 데에는 여러 도전 과제가 존재하는데, 그 중 대표적인 것은 (1) 넓은 범위의 결합 친화도(KD)를 정확히 평가하는 능력과 (2) 저분자량(LMW) 리간드를 친화도, 작용 기전 및 결합력을 열역학 특성에 기반해 정밀하게 평가하고 순위를 매기는 것이다.
단백질과 저분자 리간드 간의 결합 상호작용을 측정하고 특성화하는 것은 신약 개발에 있어 근본적으로 중요한 과정이다. 이러한 결합 상호작용을 정밀하게 특성화하는 데에는 여러 도전 과제가 존재하는데, 그 중 대표적인 것은 (1) 넓은 범위의 결합 친화도(KD)를 정확히 평가하는 능력과 (2) 저분자량(LMW) 리간드를 친화도, 작용 기전 및 결합력을 열역학 특성에 기반해 정밀하게 평가하고 순위를 매기는 것이다.
결합 데이터를 신뢰성 있게 해석하는 과정은 비활성 단백질의 존재나 단백질 농도의 부정확한 평가로 인해 복잡해질 수 있다. 또한, 화합물의 농도에 내재된 불확실성은 부정확한 농도, 낮은 용해도, 그리고 거울상 이성질체와 같은 화합물의 화학적 이질성에서 기인할 수 있으며, 이러한 요인은 데이터 해석을 더욱 어렵게 만든다.
등온 적정 열량측정법(ITC)은 결합 반응에서 방출되거나 흡수되는 열을 직접 측정함으로써, 표지(labeling)나 고정화 과정 없이 용액 상태에서 단백질-저분자 간 상호작용을 분석할 수 있는 수단을 제공한다. 고감도의 ITC 장비와 적절하게 설계된 실험 조건은 단백질 농도의 부정확한 평가나 비활성 단백질의 존재뿐만 아니라, 화합물 용액의 불확실한 농도까지도 보정할 수 있도록 한다. 품질 관리(QC)부터 분석법 개발 및 리드 화합물 최적화 단계에 이르기까지, ITC는 생화학 데이터를 보다 깊이 이해하는 데 기여한다. 단백질 및 화합물 농도의 정규화(normalization)와 비활성 단백질의 보정을 통해 결합 엔탈피 변화와 같은 중요한 생화학적 파라미터의 정밀한 평가가 가능해지며, 이는 best-in-class 약물 후보의 개발 과정에서 매우 중요한 결정 요인이 될 수 있다.
본 백서에서는 MicroCal PEAQ-ITC 및 MicroCal PEAQ-ITC 자동화 시스템, 그리고 MicroCal PEAQ-ITC 분석 소프트웨어가 제공하는 주요 이점들을 다룬다. 해당 소프트웨어는 비활성 단백질, 부정확한 단백질 농도, 또는 부정확하거나 이질적인 화합물 농도로 인해 복잡해진 결합 상호작용의 분석을 가능하게 한다.
ITC는 신약 개발의 초기 단계에서 분석법 최적화 및 보조 스크리닝뿐만 아니라, 화합물의 최적화를 포함한 후기 단계에서도 널리 활용된다. 또한, 단백질 정제 후 품질 관리(QC) 과정에서 로트 간의 변이 및 동결-해동 안정성을 평가하는 데에도 활용될 수 있다. 초기 단계의 응용에서는 일반적으로 확립된 양성 대조군(positive control)을 포함한 여러 화합물 세트를 테스트하게 된다. 이러한 양성 대조 리간드의 주기적인 사용은 단백질 품질을 모니터링하고, 일련의 ITC 실험 전반에서 활성 단백질 농도를 설정 및 검증하는 데 유용하다. MicroCal PEAQ-ITC 분석 소프트웨어는 일련의 연속적인 분석 결과로부터 도출된 결합 파라미터들을 산점도(scatter plot) 형태로 제공한다. 이러한 시각화는 경향성을 파악하고 분석 조건이나 시약 품질과 관련된 문제를 조기에 식별하는 데 도움을 준다.
아래의 그림 1은 일련의 연속적인 ITC 적정에서 얻어진 결합 자리 수(N 값)에 대한 산점도를 보여준다. 시간이 지남에 따라 나타나는 N 값의 점진적인 감소는 대상 단백질의 안정성 문제를 시사한다. 제한적인 단백질 안정성, 로트 간 변이, 그리고 동결-해동에 따른 단백질의 불안정성은 단백질-리간드 상호작용 연구에서 흔히 마주치는 문제들이다. ITC 데이터를 활용하면, 특정 단백질 로트가 이전 로트들과 비교하여 결합 활성이 상이한지를 판단할 수 있으며, 이는 스크리닝 및 특성화 과정 전반에 걸친 실험의 정규화 기준으로 유용하게 활용 할 수 있다.
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단백질의 활성 농도가 확립되어 ITC 데이터 분석에 사용된 경우, 나타나는 화학양론 값(N)이 정수(예: 1, 2 등)가 아닌 경우에는 리간드 농도의 부정확성에 기인한 것으로 판단할 수 있다
약물 개발 초기 단계에서는 화합물 용액의 농도가 상당한 오차를 포함하는 경우가 빈번히 발생하며, 이와 같은 부정확성은 결합 데이터 피팅 시 반환되는 결합 열역학 파라미터의 품질에 직접적인 영향을 미친다. 특히, 결합에 대한 엔탈피(ΔH) 및 엔트로피(-TΔS)의 기여를 정확하게 해석하는 데 있어 중요한 문제를 초래한다. MicroCal PEAQ-ITC 분석 소프트웨어는 리간드 농도의 오차를 식별하고 이를 보정하여 열역학 측정의 오류를 최소화할 수 있는 기능을 제공한다.
그림 2는 약물 후보군 발굴 및 개발 단계에서 목표로 하는 단백질과 다양한 저분자 화합물의 상호작용에 대하여 MicroCal Auto iTC 200을 통해 확인한 N값(Stoichiometry)의 산포도 이다. 이 측정은 MicroCal Auto iTC를 사용하여 고객이 수행했습니다. 측정된 N값의 분포는 0.2~1.8까지 다양하게 분포하였다. X-ray를 통한 구조 분석 결과를 통해 1:1 결합을 할 것으로 기대 되었으나 이러한 화학양론적 차이는 부정확한 리간드의 농도에서 기인하는 것으로 판단된다.
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이러한 오차는 ITC로부터 도출된 엔탈피 데이터에 직접적인 영향을 주며, 각 리간드에 대한 결합 열역학 특성을 해석하는 데 어려움을 야기한다.
새로운 MicroCal PEAQ-ITC 분석 소프트웨어는 피팅 과정에서 화학양론 값을 1로 고정한 상태에서 주사기 내 저분자 리간드(LMW ligand)의 농도를 가변 매개변수로 설정함으로써, 해당 오차를 보정할 수 있도록 설계되었다. 이 과정은 다수의 데이터 세트에 대해 자동으로 수행될 수 있으며, 그림 3은 이러한 보정 인자 적용 여부에 따라 도출된 엔탈피(ΔH) 데이터를 비교하여 보여준다.
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리간드 농도의 오차를 분석에 반영할 경우 도출되는 엔탈피(ΔH) 데이터가 현저히 달라지는 것이 명확하게 나타나며, 이는 본 리드 최적화 연구에서 구조-활성 상관관계(SAR)의 해석에 중대한 영향을 미칠 수 있음을 보여준다.
리간드 농도가 부정확할 경우 또 다른 결과로, 결합 등온선(binding isotherm)이 불완전하게 나타나 실험 데이터의 해석이 어려워지고, 실험을 반복해야 하는 상황이 발생할 수 있다. 이에 대한 예시가 그림 4에 제시되어 있다.
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MicroCal PEAQ-ITC 분석 소프트웨어는 피팅 공정에서 제어 열을 나타내는 상수 오프셋을 사용하여 이러한 불완전한 결합 등온선을 피팅할 수 있습니다. 제어 오프셋을 결합하고 피팅 공정에서 리간드 농도를 변화시킴으로써 이전에 피팅이 불가했거나 어려웠던 데이터 세트를 비주관적인 방식으로 자동으로 분석할 수 있습니다. 많은 경우에 이것으로 응용 분야에 충분하며, 적어도 화합물 스톡의 올바른 농도를 설정하는 데 사용할 수 있습니다. 이 예에서 리간드 농도는 처음에는 200µm 로 추정되었지만 이후 126µm인 것으로 밝혀졌습니다. 이 오류는 엔탈피(ΔH)와 엔트로피(-TΔS)에 큰 영향을 미쳐 각각 -2.8 kcal/mole과 2.28 kcal/mol로 변화했으며, 겉보기 KD는 241nm에서 122nm으로 변화했습니다. 이러한 차이는 분석 소프트웨어의 새로운 기능의 가치와 강력한 데이터 해석에 가져올 이점을 강조합니다.
신약 개발의 후기 단계에서는 많은 화합물들이 거울 이성질체 또는 이성질체의 혼합물 형태로 합성되는 경우가 많습니다. 이러한 경우, 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC)를 통해 혼합물을 분리하고, 개별 이성질체를 각각 시험할 수 있습니다. 그러나 거울 이성질체 혼합물의 경우, 분리가 어렵고 시간이 많이 소요되기 때문에 혼합물 상태로 직접 시험해야 하는 경우도 있습니다. 생화학적 분석은 주로 혼합물 내에서 가장 강하게 결합하는 성분에 대한 정보를 제공합니다. 반면 등온 적정 열량계(ITC)는 하나의 실험을 통해 강한 결합체와 더 약한 결합체 모두에 대한 결합 정보를 동시에 제공할 수 있습니다.
그림 5에 나타난 이중상 결합 등온그래프 (biphasic binding isotherm)은, 세포 내의 표적 단백질에 대해 거울상 이성질체 혼합물을 리간드로 주입하였을 때 ITC 데이터가 어떻게 나타날 수 있는지를 보여주는 예시입니다. 이와 유사하게, 직접 측정 가능한 범위를 벗어난 KD를 측정하기 위한 경쟁 실험(competition experiment)의 형태로 고친화성 리간드와 저친화성 리간드를 의도적으로 혼합하여 주입할 경우에도 이중상 등온그래프가 관찰됩니다. 이러한 접근법은 일반적으로 강한 결합 리간드를 표적 단백질과 약한 억제제의 혼합물에 주입하는 방식과는 다르며, 약한 상호작용에 대한 사전 지식 없이도 두 억제제를 동시에 분리 및 분석할 수 있다는 장점을 가집니다.
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복합 결합 등온적정(complex binding isotherms)의 분석에서 MicroCal PEAQ-ITC 분석 소프트웨어의 유용성을 입증하기 위해, 혼합 리간드(에톡졸아마이드(EZA)와 푸로세마이드(FUR))를 시린지에 넣어 표적 단백질(소 탄산탈수효소 II, bCAII)에 주입하는 실험을 수행하였습니다. 해당 데이터는 그림 6에 제시되어 있으며, 이는 거울상 이성질체 혼합물이나 '시린지 경쟁 실험(syringe competition experiment)'에서 기대되는 이중상 등온적정 데이터를 보여줍니다..
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이번 실험은 MicroCal PEAQ-ITC시스템을 활용하여 혼합물의 결합 특성을 정량적으로 분석할 수 있는 높은 수준의 분해능을 보여줍니다. 특히 복잡한 ITC 데이터, 그 중에서도 경쟁 실험 데이터를 피팅(fitting)하는 과정이 이전 모델의 분석 소프트웨어에 비해 MicroCal PEAQ-ITC 소프트웨어에서는 더욱 간단해졌습니다. 초기 피팅 시 조건을 잘 입력하는 것이 여전히 중요하지만, 최신 소프트웨어는 더 적절한 수치적 경계 조건을 포함하고 있어 피팅의 성공 가능성을 높이고, 피팅 오차를 최소화 하여 로컬 최소값(local minima)에 갇히는 위험을 줄여줍니다. 이러한 데이터 피팅은 소프트웨어에 내장된 Simplex 알고리즘과 Marquardt-Levenberg 알고리즘을 병행하여 활용함으로써 더욱 효과적으로 수행되었습니다. 보다 구체적으로는, 초기에는 Simplex 방법을 사용하고, 마지막에는 Marquardt-Levenberg 알고리즘으로 마무리하는 방식이 사용되었습니다. ‘two-sites’ 모델 및 ‘ligand in cell’ 설정을 사용한 이 접근법을 통해 얻어진 열역학적 파라미터는 표 1에 요약되어 있습니다.
| 세포 내 bCAII, mM | N1(부위) | kD1(nM) | DH1(kcal/mol) | N2(부위) | kD2(nM) | DH1(kcal/mol) |
|---|---|---|---|---|---|---|
| 5 | 0.5 (4) | 0.8 (100) | -15.1 (1) | 0.6 (7) | 700 (43) | -7 (13) |
| 10 | 0.49 (3) | 1 (93) | -15.2 (2) | 0.56 (3) | 630 (42) | -7.1 (5) |
이 데이터는 각각의 상호작용을 독립적으로 측정했을 때 얻어진 열역학적 값들과 잘 일치합니다(표 1의 설명 참조).
새로운 MicroCal PEAQ-ITC 장비는 향상된 신호 안정성, 혼합 효율, 신호 대 잡음비(signal-to-noise ratio)와 더불어, 소분자 신약 개발에 활용되는 생물물리학적 분석 실험실에서 사용하기에 적합한 데이터 분석 소프트웨어를 함께 제공합니다.
이 소프트웨어는 데이터 품질 평가와 분석 과정을 완전히 자동화하여, 사용자 주관에 의한 편차를 최소화합니다. 데이터 품질 평가와 피팅은 매우 빠르게 수행되며, 50개 이상의 대용량 실험 데이터를 몇 초 만에 분석할 수 있습니다.
새로운 MicroCal PEAQ-ITC 분석 소프트웨어의 주요 추가 기능 중 하나는, 적절한 대조 실험을 수행할 경우 표적 단백질의 활성 농도 또는 리간드 농도, 혹은 그 둘 모두를 결정할 수 있다는 점입니다. 이는 결합 친화도 및 열역학적 파라미터를 보다 정확히 측정할 수 있게 하여, 히트 밸리데이션(hit validation)과 리드 최적화(lead optimization) 단계에서 엄격한 구조-활성 관계 분석(Structure-Activity Relationship, SAR)을 가능하게 합니다.
또한, 이 새로운 ITC 데이터 분석 소프트웨어는 거울상 이성질체혼합물, 경쟁 실험, 또는 다중 결합 부위를 가진 표적 단백질을 적정할 때 관찰될 수 있는 복잡한 결합 등온적정 그래프를 보다 간단히 피팅할 수 있는 도구들을 제공합니다.
