将通过 DSC 获得的热稳定性数据与蛋白质稳定性相关联来预测生物药剂的长期储存行为

简介

在使用期限内，医用蛋白质在处理和储存期间会经历各种不同的条件。 其中包括储存和运输期间 pH 值较低、缓冲液成分和离子强度差别以及温度波动。 此外，最终制剂必须在若干年的时间内保持稳定，且通常蛋白质浓度非常高。 最终提供给病人的药品必须保持其天然构象和活性，且保证最低程度的自缔合和聚合。 可以筛选这些条件对蛋白质构象和自缔合的影响的任何分析工具都有助于选择最佳的生物治疗药物以及应使用的工艺和制剂条件，从而在研发过程中取得进一步的进展。

DSC 是在不同缓冲液条件下评估蛋白质热稳定性和构象稳定性的常用方法 (1-6)。 蛋白质或每个结构域的熔解温度可通过 DSC 数据图获得 (6)。 如果反应可逆，还可以确定去折叠的热力学参数。 此外，去折叠常伴随着放热，放热与去折叠蛋白质的聚合和沉淀有关。

DSC 可用于表征抗体和 Fc 片段的热诱导去折叠，且可识别单个结构域的跃迁 (6-9)。 C_H2 结构域通常第一个去折叠 (7)，其次是 Fab，然后是 C_H3 结构域。

一些对照实验（图 1）表明，在 PBS 中，近生理条件下，Fc 片段的 C_H2 和 C_H3 结构域分别在 71.0°C 和 83.1°C 条件下去折叠。 单克隆抗体 (MAb) Fab 结构域的热跃迁通常发生在 C_H2 和 C_H3 结构域跃迁之间，或与两者其中之一重叠。

图 1：PBS 中 Fc 片段的 DSC 扫描图。

SEC 或凝胶过滤 (GF) 常用作稳定性指示分析，可对蛋白质经受的条件或储存期间产生的单体和其他更高分子量的物种进行定量。

在此处所述的工作中，根据 SEC-HPLC 分析，我们对比了在不同温度下储存在不同条件下的不同抗体和 Fc 结合蛋白质的稳定性，并通过 DSC 预测了在相同缓冲液中的稳定性。 结果表明，DSC 可用于选择蛋白质可保持最高稳定性的长期储存条件，还可用于按照相对长期稳定性筛选不同的相关蛋白质（例如蛋白质类似物）。

材料和方法

样品准备

除非另行说明，样品是在指定 pH 值下的含有 140mM NaCl 的20 mM 柠檬酸钠溶液中制备。 每种蛋白质制备两组相同的样品：一组用于 DSC 分析，另一组用于 HPLC 分析。 所有实验均在蛋白质浓度为 0.5 mg/ml 的条件下进行。

储存温度

所有样品的默认储存温度为 4°C。 但对于此研究中使用的大部分蛋白质，在此温度下观察聚合变化需要几个月或几年，这反映了成功的医用蛋白质应具有较长的保质期。 因此，还使用了 37°C 作为储存温度，以便在限制时间（两个月）内完成此项目。

SEC-HPLC

本研究使用了带有在线 UV 光散射和示差折光检测器 (SEC-UV/LS/RI) 的商用 SEC-HPLC 系统。 Tosoh TSKgel™ G3000SWXL (7.8 × 300 mm) SEC 色谱柱流速为 0.5 ml/min，样品在指定时间注射。 UV 色谱监控在 280 nm。

DSC

DSC 实验使用 Malvern MicroCal VP-DSC 系统进行。 所有样品在分析前脱气五分钟。 参比池中注入与样品缓冲液相一致的缓冲液。 以 60°C/h 的加热速率将样品从 4°C 加热到 110°C。 预扫描时间为 15 分钟，筛选时间为 10 s，反馈模式/增益设为无源。 使用 Origin™ 7 软件分析数据，获得热跃迁温度 (Tm) 的中点。

结果与讨论

Fc 结合蛋白质

图 2 显示了不同 pH 值条件下 Fc 结合蛋白质 X 的 DSC 扫描图。 扫描的热跃迁温度也包括在内。 在 pH 为 7 时，在 65.4°C 和 78.9°C 有两次热跃迁，对应 CH2 和 CH3 结构域的去折叠。 随着 pH 下降，热跃迁温度也下降，DSC 预测的稳定性顺序为 pH 7 > pH 5 > pH 4。 实际的蛋白质稳定性使用带有在线 UV 光散射和示差折光检测器的 SEC-HPLC 系统研究。 使用光散射检测器的优点在于容易确认单体峰 (10)。 图 3 和 4 分别显示了储存在 4°C 环境中的 Fc 结合蛋白质 X 在 pH 为 7 和 4 条件下的 SEC 色谱。 图 5 所示为储存在 4°C 环境中的 pH 7、pH 5 和 pH 4 样品在不同时间点的单体峰值百分比对比。 本应用报告中所有 SEC 单体数据的百分比值都根据 T = 0 条件下的值进行标准化。

图 2：pH 7、pH 5 和 pH 4 条件下 Fc 结合蛋白质 X 的 DSC 扫描图。

图 3：储存温度为 4°C 时 Fc 结合蛋白质 X 在 pH 7 条件下的 SEC 色谱（吸光度为 280 nm）。 进样时间点为 T000 = 0 h、TM30 = 30 min、T001 = 1 h 以及 T150 = 150 h。

图 4：储存温度为 4°C 时 Fc 结合蛋白质 X 在 pH 4 条件下的 SEC 色谱（吸光度为 280 nm）。 进样时间点为 T000 = 0 h、TM30 = 30 min、T001 = 1 h 以及 T150 = 150 h。

图 5：4°C 时抗体的稳定性 pH 7、pH 5 和 pH 4 条件下不同时间点的单体峰值百分比对比。 本应用报告中所有 SEC 单体数据的百分比值都根据 T = 0 条件下的值进行标准化。

由于在 4°C 条件下很难在几星期内区分 pH 7 和 pH 5 样品的稳定性，在 37°C 条件下进行了加速研究。 图 6 显示了 pH 7 和 pH 5 样品在不同时间点通过 SEC 获得的单体峰值百分比对比。 储存在 37°C 环境中时，Fc 结合蛋白质 X 在 pH 7 和 pH 5 条件下的稳定性可以明确区分。 在 37°C 条件下储存时，单体峰值百分比上升超过 100% 的原因是蒸发，所有样品在 37°C 条件下均观察到此现象，因此导致所有样品中的蛋白质浓度升高。

图 6：37°C 时抗体的稳定性 通过 SEC 获得的 pH 7 和 pH 5 在不同时间点的单体峰值百分比对比。

以上两组实验（4°C 和 37°C）的 SEC 结果明确表明 Fc 结合蛋白质 X 的实际稳定性顺序为 pH 7 > pH 5 > pH 4，确认了 DSC 预测。

图 7 显示了 Fc 结合蛋白质 X 在 pH 为 6 和 5 条件下的 DSC 扫描图。 图 8 所示为储存在 37°C 环境中后通过 SEC 获得的 pH 6 和 pH 5 在不同时间点的单体峰值百分比对比。 结果再次表明 DSC 预测的稳定性顺序 (pH 6 > pH 5) 与从 SEC 获得的实际稳定性数据具有很高的一致性。

图 7：pH 6 和 pH 5 条件下 Fc 结合蛋白质 X 的 DSC 扫描图。

另一个影响表观热稳定性的因素是去折叠蛋白质的溶解度。 使用 Malvern MicroCal VP-DSC，跃迁后最后的放热曲线（负坐标方向的急剧下降曲线）反映了去折叠蛋白质的溶解度。 这是除跃迁温度外另一个可能对蛋白质稳定性有明显影响的因素。

聚合/沉淀是不可逆反应。 当这种不可逆反应发生时，去折叠反应的可逆平衡就会向有利于去折叠形式蛋白质的方向转移。 这样一来，去折叠中间物的溶解度越低，去折叠和聚合反应就会随时间推移发生得越多。 如果聚合与第一次热跃迁同步，其将在整个反应前发生。 这将使分析更为复杂。

抗体

在研究 Fc 结合蛋白质 X 后，对 MAb 使用相同的方法和程序。 图 9 显示了不同 pH 值条件下 MAb Y 的 DSC 扫描图。 图上标记了热跃迁温度。 在 pH 7 条件下，只在 73.2°C 时有一次热跃迁，之后几乎立即发生聚合放热。 pH 下降时，C_H2 结构域的热稳定性下降，pH 5 和 pH 4 样品的 Tm 值分别为 66.1°C 和 47.9°C。 DSC 预测的稳定性顺序为 pH 7 > pH 5 > pH 4。

图 8：37°C 时的稳定性对比，通过 SEC 获得的 pH 6 和 pH 5 在不同时间点的单体峰值百分比。

图 9：pH 7、pH 5 和 pH 4 条件下 MAb Y 的 DSC 扫描图。

再次使用 SEC-HPLC 研究实际的蛋白质稳定性。通过光散射检测方法确认单体峰值 (10)。 对比了储存在 4°C 环境中的 pH 7 和 pH 4 样品在不同时间点的单体峰值百分比（未显示结果）。 由于用多达几个月时间进行探索实验来区分 4°C 环境中 pH 7 和 pH 4 条件下 MAb Y 的稳定性并不可行，因此在 37°C 环境下进行了加速降解研究。

图 10 所示为储存在 37°C 环境中的 pH 7、pH 5 和 pH 4 样品的单体峰值百分比对比。 实验结果确认了 DSC 预测的稳定性顺序：pH 7（略微）> pH 5（显著）> pH 4。

图 10：37°C 时的稳定性对比，通过 SEC 获得的 pH 7、pH 5 和 pH 4 在不同时间点的 MAb Y 单体峰值百分比。

相同缓冲液中的不同蛋白质

如上文所述，我们研究了相同蛋白质在 pH 值不同时热稳定性与蛋白质稳定性之间的联系。 我们还想探索是否可以使用相同的方法对比不同蛋白质在相同缓冲液条件下的稳定性。 一般而言，在对比不同的蛋白质时，相对热稳定性和
相对长期稳定性之间的相关性随着蛋白质结构相似度的下降而下降。 DSC 已被成功用于评估相关蛋白质的稳定性，包括筛选相同蛋白质的类似物。

图 11 显示了通过 DSC 扫描图获得的 MAb Y 和 Fc 结合蛋白质 X 在 pH 4、pH 5 和 pH 7 条件下的热跃迁温度对比。 图 12 至 14 显示了 MAb Y 和 Fc 结合蛋白质 X 在 pH 4、pH 5 和 pH 7 条件下的单体峰值百分比对比。 在 pH 4 和 pH 5 条件下，SEC 稳定性数据明确证实了 DSC 预测的稳定性顺序（MAb Y > Fc 结合蛋白质 X）。 pH 7 的数据较为复杂。 DSC 稳定性数据显示，MAb Y 比 Fc 结合蛋白质 X 更为稳定，但 SEC 数据中的差别并不明显。

有几个可能的影响因素可能会造成这种情况。 一个是两种蛋白质在 pH 7 条件下都非常稳定，SEC 需要更长的储存时间来确定单体数量的差别。 另一个可能因素是去折叠 Fc 结合蛋白质 X 比 MAb Y 更易溶解（图 2 和 9），这在一定程度上补偿了热跃迁温度中的差别，且使两种蛋白质的实际稳定性比仅通过热跃迁温度预计的稳定性更为相似。 这表明聚合放热也是需要考虑的重要因素。

本文中所述的方法也被用于研究若干种不同的蛋白质，包括抗体和 Fc 轭合物。 通过 DSC 数据得出的热稳定性相对顺序不仅反映了 SEC-HPLC 分析所得的相同蛋白质在不同缓冲液中的实际储存稳定性和聚合情况，还反映了一般情况下不同相关蛋白质的实际储存稳定性和聚合情况。

在建立特定蛋白质的热稳定性与储存稳定性之间的关联后，DSC 可用于快速评估不同的突变体、不同的结构、Fc 相关蛋白质和 MAb。 如上文所述，除了热跃迁温度外还需要考虑其他因素，例如去折叠蛋白质中间物的溶解度以及蛋白质结构中的相似性和区别。

图 11：通过 DSC 扫描图获得的 MAb Y 和 Fc 结合蛋白质 X 在 pH 7、pH 5 和 pH 4 条件下的热跃迁温度对比。

图 12：MAb Y 和 Fc 结合蛋白质 X 在 pH 4 条件下的单体峰值百分比对比。 储存温度为 4°C。

图 13：MAb Y 和 Fc 结合蛋白质 X 在 pH 5 条件下的单体峰值百分比对比。 储存温度为 37°C。

图 14：MAb Y 和 Fc 结合蛋白质 X 在 pH 7 条件下的单体峰值百分比对比。 储存温度为 37°C。

结论

DSC 被用于研究单克隆抗体和 Fc 结合蛋白质在不同 pH 值条件下的热稳定性。 SEC-HPLC 被用于研究同一组蛋白质在相应的 pH 值条件下的储存稳定性。 SEC-HPLC 稳定性数据与 DSC 预测的稳定性相一致，表明通过 DSC 获得的热稳定性数据与低温条件下的蛋白质稳定性具有相关性。 此外，相关蛋白质的相对热稳定性还反映了实际长期稳定性方面的差别。 因此，DSC 是非常有用的工具，可预测蛋白质在低温条件下的稳定性、筛选缓冲液和辅料、筛选最佳治疗药物以及预测蛋白质聚合情况。

致谢

本应用报告由加利福尼亚州千橡市 Amgen Inc. 的 Jie Wen、Yijia Jiang、Kathryn Hymes*、Ke Gong* 和 Linda Narhi 友情提供。
*暑期实习生

参考文献：

1. Privalov P. L . Stability of proteins, in Advances in Protein Chemistry Vol 33 Academic Press, Inc., pp167-241 (1979).
2. Privalov P. L . Stability of proteins, in Advances in Protein Chemistry Vol 35 Academic Press, Inc. pp. 1-101, (1982).
3. Privalov P. L . Stability of protein structure and hydrophobic interaction in Advances in Protein Chemistry Vol 39 Academic Press, Inc., pp. 191-234 (1988).
4. McCrary, B. S, et al. Hyperthermophile protein folding thermodynamics. J. Mol. Biol. 264, 784-805 (1996).
5. Pace, C. N. et al. Conformational stability and thermodynamics of folding ribonucleases Sa, Sa2, and Sa3. J. Mol. Biol. 279, 271-286 (1998).
6. Welfle, K. et al. Conformation, pH-induced conformational changes, and thermal unfolding of anti-p24 (HIV-1) monoclonal antibody CB4-1 and its Fab and Fc fragments. Biochim Biophys Acta 1431, 120-131 (1999).
7. Tischenko, V.M. et al. Investigation of the cooperative structure of Fc fragments from myeloma immunoglobulin G. Biochemistry 37, 5576-5581 (1998).
8. Vermeer, A.W. et al. The unfolding/ denaturation of immunogammaglobulin of isotype 2b and its F(ab) and F(c) fragments. Biophys . J. 79, 2150-2154 (2000).
9. Vermeer, A.W. and Norde, W. The thermal stability of immunoglobulin: unfolding and aggregation of a multi-domain protein. Biophys . J. 78, 394-404 (2000).
10. Wen, J. et al. Size-exclusion chromatography with on-line light-scattering, absorbance, and refractive index detectors for studying proteins and their interactions. Anal. Biochem. 240, 155-166 (1996).