為樣品選擇最佳 GPC/SEC 柱組合

如果您曾經使用過 GPC/SEC（例如 OMNISEC），您會知道所有分析都依賴於柱組合。選擇適合您的應用領域的柱子有時可能會很困難。有時，不同類型的樣品可能需要全新的柱組合。

在選擇最適合樣品的柱組合時，有多個因素需要考慮。包括分子大小/重量範圍，樣品溶解所用流動相與柱的相容性，樣品中的官能團與柱定相的相容性，等等。如果使用多個柱子，應考慮它們是否相輔相成，以及應按何種順序連接。

在這篇文章中，我們將提供有關柱子的一般信息，並對如何製作適合樣品的柱組合提供見解。這裡的信息主要與如何從分子大小/重量範圍的角度選擇最佳柱組合有關。有關可用於多種流動相分析的柱子的更多信息，請參考這篇文章和網絡研討會。

柱組合中會發生什麼？

讓我們從簡要概述 GPC/SEC 柱組合內的分離如何運作開始。如上圖所示，大小不同的兩個樣品的溶解混合物被導入柱中。隨著時間的推移，兩個樣品分餾物和溶解溶劑以不同的速度通過柱子移動。最大樣品首先洗脫（群體 2），然後是較小的樣品（群體 1），最後是溶解溶劑。

理解分離是基於分子尺寸而非分子量是很重要的！

這種分離之所以能夠發生，原因是柱子的定相是由具有孔隙的凝膠粒子組成的。這些孔足夠大，使樣品分子在通過柱子時擴散進去。小分子更容易擴散進孔中，因此會在孔中停留的時間比中大型分子更長。最大分子不易擴散進孔中，因此通過柱子的路徑更簡單，更快。

使用 GPC/SEC 時，分離以分子大小為基準，較大分子先洗脫，然後是中等大小的分子和小分子。請參考下面的動態描述。大的三角形在不花費太多時間於孔擴散的情況下先洗脫，中等大小的方形緊隨其後，最後，小圓可以容易地進入孔中。

混合層與單一孔徑柱

這兩種柱的區別詳述於這篇文章。簡而言之，混合層柱包含具有混合粒子和孔徑的定相凝膠，提供跨越廣泛分子大小/重量範圍的分辨力。單一孔徑柱包含均質定相凝膠，提供相對有限的分子大小/重量範圍內的卓越分辨力。

如何結合柱子以創建柱組合

要創建針對樣品優化的柱組合，可能需要結合兩個或更多柱子。（不過，如果一個柱子能夠提供足夠的分辨力，且是所需的全部，那麼就不需要結合多個柱子。）這樣可以節省時間和流動相。這在蛋白質樣品的情況下尤其常見。儘管蛋白質的分子量覆蓋廣泛範圍，但由於摺疊結構，蛋白質樣品的大小範圍比高分子聚合物的大小範圍窄。

當結合柱子以創建組合時，有三種常見的途徑可以採用。我們建議您考慮這些方法，但這並非全部。

兩個混合層柱：這是最常見的通用柱組合，包括有機柱、水性柱及特別柱子。值得注意的是，我們將使用兩個相同的混合層柱。例如，在分析多糖批次時，我們經常使用兩個 A6000M 柱子，一種適用於水溶性分析的混合層柱。使用這樣一個由兩個混合層柱子組成的組合，趨向於達到最大化分子大小/重量範圍分辨率，並將運行時間控制在約 45 分鐘或更短。

高/低分子量柱與混合層柱結合：在樣品中出現特別大或小的聚合物大小/重量極端情況（如聚集體或寡聚物）時，我們更喜歡在一個混合層柱上附加一個高/低單一孔徑柱。這樣可以在分子大小範圍的一個極端提供足夠的分辨率來捕捉樣品的特點，而混合層柱可以捕捉剩餘樣品物質。如果您希望提高樣品和溶劑峰之間的分辨力，可以向混合層柱中加一個低分子量柱。

結合多個單一孔徑柱：此策略適用於知道不需要混合層柱提供的整個分子大小/重量範圍分辨率的情況。在類似樣品的 QC 環境中，這樣的柱組合可能特別有用。優勢在於您可以在與樣品相關的分子大小/重量範圍內獲得最高的分辨力。結合如 T5000 + T3000 + T1000 這樣的兩個或更多的單一孔徑柱也可以涵蓋廣泛的分子大小/重量範圍。這種情況下，分析時間可能會延長，但提供更好的分辨率。

當結合單一孔徑柱時，確保柱子不止一個之間的間隔很重要。這可以防止分辨率範圍的差異。回顧上面三個單一孔徑柱的例子，簡單結合 T5000 + T1000 不推薦。因為分辨率範圍的差異可能會生成像下圖這樣的洗脫曲線，影響分析的數據，導致生成樣品結果中出現不自然的峰形和假象。

柱子的順序

很多人會問‘結合柱子時，應按何種順序連接’。

我們推薦的一個合理順序是，先從最高的分子大小/重量柱開始，然後依次減小。這樣，當整個樣品混合物首次導入柱組合時，最大分子可以開始分離。如果將柱子順序逆過來，最大的分子可能會被壓迫過小尺寸/重量的柱子，這可能干擾小分子的擴散進孔中。

這就是為什麼在我們的例子中，我們使用 T5000 + T3000 + T1000 柱子的原因。當將單一孔徑柱結合到混合層柱時，將高分子大小/重量單一孔徑柱放在混合層柱前，將低分子大小/重量單一孔徑柱放在混合層柱後。