最佳實踐：蛋白質及生物聚合物的差示掃描量熱法

在之前的博客文章中，我討論了如何利用MicroCal DSC獲得高質量數據的最佳實踐。以下是關於MicroCal PEAQ-DSC系統以及MicroCal VP-Capillary DSC和VP-DSC系統的更多最佳實踐。這些最佳實踐適用於溶液中蛋白質和其他生物聚合物的分析。

樣品要求：

• 為了獲得高質量的差示掃描量熱法(DSC)數據，樣品需放在所需的緩衝液中（pH、鹽、賦形劑等），並在DSC參考池中使用匹配的緩衝液進行緩衝液-緩衝液掃描。
• 通過透析、去鹽柱或其他緩衝液交換方法準備樣品。
• 保存透析/緩衝液交換所得的緩衝液，用於參考池、緩衝液-緩衝液掃描及樣品稀釋。
• 推薦的蛋白質濃度範圍為0.1 mg/ml到2 mg/ml。
• DSC所得的T_m可能與濃度相關。
  • 對於T_m篩選和可比性/相似性研究，確保所有蛋白質濃度相匹配。

DSC設定：

• 在使用DSC進行T_m篩選和可比性/相似性研究時，確保所有設置相同，包括掃描速率、溫度範圍、反饋模式、預掃描恆溫。
  • T_m和DSC熱圖可能依賴於掃描速率和反饋模式。
• 溫度範圍：掃描開始於第1 ^st T_m以下10-20°C，結束於最終T_m以上10-20°C。
• 掃描速率：
  • 蛋白質和核酸的一般掃描速率為60到90°C/h
  • 脂質的一般掃描速率為30到60°C/h
  • 對於MicroCal PEAQ-DSC和VP-Capillary DSC，使用180到240°C/h的掃描速率以增加T_m篩選的樣品通量
• 推薦的“反饋模式”：
  • 蛋白質—無或低
  • DNA和RNA—低或中
  • 脂質—高
• 推薦的“預掃描恆溫”時間為3到15分鐘。

對於自動化MicroCal PEAQ-DSC和VP-Capillary DSC系統：

• 確保樣品在DSC分析前儲存在適當的溫度下。對於蛋白質和其他生物分子，將冷卻架溫度設為5到10°C。如果您研究的是熱穩定材料，可以將冷卻架溫度設為25°C。
• 使用至少三次的滲透補充（在VP-Capillary DSC中稱為“填充劑次數”）從96孔板對DSC池進行填充。
• 使用20% Contrad 70或14% Decon 90進行池清洗編程。

DSC原始數據質量：

• 總是進行匹配的緩衝液-緩衝液掃描（在相同的掃描條件下進行），用以數據分析。如果需要，可以在每次樣品前進行一次緩衝液-緩衝液掃描。
• 頻繁的緩衝液-緩衝液掃描是額外的儀器性能檢查，以確保DSC池乾淨，儀器運作正常。
• 緩衝液-緩衝液掃描應在整個序列中具有可再現性（假設相同的DSC運行參數）。
• 使用自動化PEAQ-DSC及其高效的清洗泵和優化的DSC池清洗協議，可以連續進行三個（或更多）樣品的運行，而無需中間進行緩衝液-緩衝液掃描。
• 原始DSC熱圖的DP值（以mcal/min為單位）在開始緩衝液-緩衝液或水水掃描時應接近零。
• 在蛋白質掃描開始時，DP值通常會相比於匹配的緩衝液-緩衝液掃描更為負。更高的蛋白質濃度會有更大的負向偏移。在良好的緩衝液匹配下，每1 g/L的蛋白質，這種DP差異應約為0.15到0.25 mcal/min（圖1）。
• 如果蛋白質與緩衝液-緩衝液掃描之間的DP差異大於1 mcal/min，這可能是由於蛋白質和緩衝液之間的緩衝液不匹配、池不乾淨、池未填滿、池中有氣泡或蛋白質濃度過高（圖2）。

圖1。

圖2。

觀看此視頻解釋什麼是差示掃描量熱法

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