生物製藥開發中的物性評估技術：候選選擇

我們介紹了生物製藥開發各階段中應評估的項目，以及那些項目可以利用馬爾文帕納利科的測量技術進行評估。在此頁面中，我們將詳細介紹”候選選擇”。

通過粒徑分布進行粒徑決定、會合及聚集體的評估（DLS）

Globin的尺寸測量

從許多候選者中快速簡便篩選目標樣本是很重要的。動態光散射法（DLS）能在幾分鐘內確認樣品顆粒的大小及其分散狀態，能迅速判斷會合及聚集體的混入。下圖顯示了横軸代表尺寸（流體力學半徑），縱軸代表光強度分佈（Intensity(%)），測量了不同Globin的粒徑分布結果。從表中可以看出，散射強度基準值為100％的HbA（藍色）和Hemocyanin（黑色）是單一的峰值。而下降的Rice Hb1（綠色）和Polytaur（灰色）的粒度分布廣泛，粒徑大的分子混雜在一起。

通過使用DLS，可以通過確定粒徑及觀察峰面積比來識別樣品中的單體、二聚體和更高次的寡聚體的比例。此外，DLS也可以通過粒徑信息估計分子量，從而有效用于確定寡聚體狀態和樣品中存在的凝聚體的比例。

使用多種檢測器進行精確的分子量和結構信息評估（SEC-LS·Vis）

apo-RD與holo-RD的評估

使用標準物質的基於保持容量的傳統解析方法中，若因蛋白質的結構變化而使表觀體積增大，分子量可能會被錯誤判斷。為求取準確的分子量，將尺寸排除色譜法（SEC）與光散射檢測器（LS）連接進行散射光解析是有效的。下圖是在有（holo）和無（apo）CaCl₂的情況下，使用SEC測量結構變化的Repeat in Toxin Domain（RD）蛋白質結果。對比holo狀態（實線）與apo狀態（虛線），apo比holo的出現時間早，傳統方法解析得到apo的分子量為約600 kDa，而holo的分子量為73 kDa，從而被解析為apo處於聚集狀態。但使用光散射的解析表明，如表所示，兩者的分子量都相同，約為73 kDa。此外，從粘度檢測器獲得的固有粘度也對比顯示，apo為0.35 dL/g，holo為0.055 dL/g，如此不同表明Ca離子存在時，蛋白質正在進行結構變化。

通過同時測量多個檢測器，能獲得準確的分子量及結構信息，避免構造選擇過程中的誤導。

使用多個檢測器進行粒徑決定及會聚、聚集體的評估（SEC-LS·Vis）

抗體的純度評估

散射光隨著分子量的增大而變得更強。將SEC與光散射檢測器連接，可以更加清楚地識別RI或UV/VIS檢測器難以分辨的聚集體區域。下圖中，使用連接於SEC的RI檢測器及光散射檢測器測量了IgG。單體及二聚體均可用RI信號（紅色）和光散射信號（橙色）確認，但在聚集體區域，光散射信號比RI信號更強（紅色箭頭）。RI檢測器及UV/VIS檢測器的信號變化取決於濃度，對僅有的少量聚集體，信號量會變小。加入光散射檢測器後，可以辨別聚集的存在，或是基線的變動。

借助SEC-LS·Vis，可以確認樣品的更準確的純度，從而能選擇更高純度和更理想的構造。

通過熱穩定性比較進行構造選擇（DSC）

Fab變異引入的12種抗體的熱穩定性比較

已知蛋白質隨變異引入而改變活性及穩定性，提升穩定性被認為也會影響活性。差示掃描熱量計（DSC）能在沒有標記的情況下進行蛋白質的熱穩定性評估。下圖顯示的是識別破傷風類毒素的抗體野生型（WT）和12種Fab變異引入體的DSC測量數據。橫軸代表溫度，縱軸代表導致變性所需的熱容量。WT Fab的T_m（主峰峰頂溫度）為78.7℃，而變異型V11提升到了92℃，穩定性提升了13.3℃。

利用DSC，可以比較抗體可變區的微小序列變化對熱穩定性的影響，從而縮小範圍篩選出更穩定的構造候選。

通過結合活性進行構造選擇（ITC）

組蛋白伴侶與三種不同組蛋白肽的相互作用

在藥物開發中，如何有效選擇對目標蛋白質具有更高親和力的候選者至關重要。等溫滴定量熱法（ITC）能根據一次測定來測量分子間相互作用的親和力、特異性和結合機制。

下圖比較了組蛋白伴侶TAF3（TBP結合因子）的PHD域（植物同源域）與三種不同組蛋白肽（10-mer）的相互作用。上面一行是測量的原始數據，下面一行是橫軸為摩爾比，縱軸為因相互作用缺失的焓變（△H）。這些相互作用均呈現單一sigmoid曲線，表現出典型1:1結合，擬合解析表明不同肽的親和力不同。親和力的不同反應在曲線的傾斜度上，傾斜度越接近垂直表示親和力越強，傾斜度越平表示親和力越弱。

使用ITC，能進行更高親和力的構造選擇。

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