N值 ITC 數據

不要丟掉你的“壞” N值 ITC 數據

N值通常被稱為化學計量，常用來作為“好”或“壞”滴定的指標。其推理如下——“如果我的N值與預期的化學計量（通常為1）相差20%或更多，那麼我的滴定結果就是無效的”。事實上，情況並不總是如此。重要的是要了解，ITC 的 N值並不等同於化學計量（結合比）。當我們用於擬合的濃度是正確且100%活性時，N值的確等於化學計量。表達N值的一種方式如下：

這個方程中的任何一個值都可以改變 N，這意味著 N 既是結合比的測量，也是樣品活性的指標。為了獲得第三個值，必須知道（或假設）這三個值中的兩個。例如，如果對化學計量感興趣，那麼提供給擬合的濃度必須是準確且100%活性的。如果關心的是細胞中樣品（通常是蛋白質）的活性，那麼必須假設注射器（配體）中樣品的化學計量和活性濃度。

看圖1：

提供的濃度是20uM的蛋白質（在細胞中）和200uM的配體（在注射器中），N=0.86。可能這兩個（或兩個）濃度中的一個不準確，可能的結合比為1:1（N=1）或1:2（N=0.5，2個蛋白質：1個配體）。如果我們假設它是1:1且200uM的配體是正確的，則用17uM的蛋白質重新擬合數據將使N變為1，這意味著蛋白質的實際結合濃度為17uM。在新的PEAQ數據分析軟體中，任何3個未知量（N，[蛋白質]，[配體]）都可以設為可變數。

N值可以很容易地視覺化為ITC S形曲線中間（拐點）的位置。有些滴定沒有明顯的拐點——它們要麼是1）低C值（平坦曲線），要麼2）太早達到飽和，原因要麼是細胞中的活性濃度太低，要麼是配體濃度太高。

1)      在低C值的情況下，問題是親和力弱和低濃度，導致平坦的曲線。參見圖2：

Kd介於中高uM範圍，但蛋白質濃度僅為50uM，這導致曲線平坦。為了將其轉變為具有明確中點的S形曲線，我們需要有比Kd高10倍（或更高）的蛋白質濃度。通常這不是一個選擇，因此研究人員採用所謂的低C值滴定——在這種情況下，蛋白質濃度保持較低，但配體濃度提高，以便曲線達到某種程度的飽和（注意高摩爾比）。這樣的曲線缺乏拐點，因此N值是未知的，必須在擬合時假設並固定為一個常數值。

2)      在“提前”飽和的情況下——問題是濃度不準確，N值顯得非常小。例如在圖3中：

如果我們在擬合過程中讓N變化，我們會得到一個值為0.0008，肯定不是實際的化學計量，此外，dH異常高（生物交互作用的dH很少超過30 kcal/mol）。

如何從這樣的滴定中提取可靠的Kd和dH數據？通過執行使用假設的極端N值的擬合，並記錄Kd和dH的變化。例如，我們可以假設圖2的化學計量在0.1和5之間，這基於我們在這2個邊界情境下獲得的合理擬合質量。在這種情況下，Kd變化很小——分別從980uM到588uM。類似地，在圖3中，Kd從25uM到37uM，對於N值從0.2到接近0。

即使非S形曲線分析起來更具挑戰性，也不應該認為它們是不充分的結果。Kd值可能無法確定得到絕對值，但即使當N值（及其延伸的活性濃度）不確定性很大時，它們通常會收斂到相對較窄的範圍內。

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