書籍摘錄文章：使用等溫滴定型熱量計（ITC）分析分子間交互作用的熱量評估

實驗醫學別冊《為創新藥物研究的交互作用解析完整指南》（生命科學及醫學專業出版社羊土社出版）第1章 創新藥物中的交互作用解析標準 – Ⅰ 低中分子創新藥物 – 5（長門石曉，津本浩平著）中刊載的相關ITC文章。本文章經羊土社同意後刊載。

使用等溫滴定型熱量計（ITC）分析分子間交互作用的熱量評估

長門石曉，津本浩平

實驗目的與重點

等溫滴定型熱量計（ITC）是一種檢測分子間交互作用的熱量變化設備。根據分子間交互作用中的熱量變化，可以直接了解非共價鍵結合的熱力學性質。因此，例如可以獲得通過篩選得出的種子及命中化合物的結合模式和特異性的信息。在結構優化中，可通過熱力學參數精確分析交互作用是否依據設計策略發生。結合結構信息，不僅可對設計指標進行嚴格檢驗，還可連接至下一個設計策略。

緒論

在低分子醫藥品開發中，低分子與蛋白質的結合是其特異的交互作用模式的關鍵。因此，在探索、驗證及優化的每一個步驟中，獲取特異性的知見很重要。分子間的非共價鍵形成、蛋白質的立體結構或構象變化，以及因處於水溶液中引起的水化狀態變化，這些都是放熱及吸熱反應的因素。因此，在目標分子的交互作用分析中，熱測量可提供重要指標。等溫滴定型熱量計（isothermal titration calorimeter, ITC）是能觀察到欲檢測的交互作用熱量變化的唯一分析方法，可進行精確的熱力學分析。關於ITC的基本使用方法參見第1章-13。

優化：因透過驗證預期目標蛋白質的特異性，確定命中化合物。從這些命中化合物中，通過延長骨架和添加/改良官能基來提升結合親和性及功能活性。此結構拓展稱為優化。

以下介紹一例關於低分子醫藥品優化中熱力學知見有效性的重要回顧研究。將AIDS治療藥物HIV蛋白酶抑制劑的目標蛋白質熱力學參數總結在圖1A^1，2）中。此圖將各抑制劑從初始（1996年）批准的IDV到接下來10年間研發的抑制劑依照批准順序排列。隨著新抑制劑的批准，與目標蛋白質的結合親和性更高（ΔG更負）。但尤為關注的是，其熱力學輪廓（圖1B）。

初始藥物（IDV等）是結合焓（ΔH）不利而結合熵（ΔS）有利的熵驅動型。隨著藥物優化，從熵驅動型轉變至焓驅動型，熱力學參數平衡改變（圖1B）。初始抑制劑熵貢獻較大，而新批准的抑制劑焓貢獻較多。此外，這些抑制劑還存在ΔH-ΔS補償的相關關係。此類趨勢也出現在高膽固醇血症治療藥他汀，骨質疏鬆症治療藥雙磷酸鹽製劑中^3，4）。以上結果顯示，與目標蛋白質的高特異性，即焓驅動與熵驅動的雙面貢獻，在藥物優化中為重要因素。故此，在提升藥效的結構優化與改良中，解讀官能基如何貢獻於熱力學，是了解分子標的藥質量的非常有用知見導入。導出特異性以了解各官能基對焓或熵貢獻，並不容易。然而，驗證熱力學參數及理性設計藥物，是提供低分子設計在創建與標的蛋白質結合的特異性至關關鍵的信息。

準備

基本配製方法參見第1章-13。使用化合物時，通常含有DMSO，需細心避免濃度波動。

協議

基本操作及實驗步驟參見第1章-13。建議將蛋白置於細胞側，化合物置於注射器側。

解決難題

注意DMSO引起的熱量變化
使用化合物時，常為含DMSO的測試系，因此常觀察到超出預期的大反應熱或稀釋熱。DMSO於ITC中與相互作用的反應熱有影響，因樣品製備於細胞側、注射器側分別進行，需細心避免DMSO濃度錯誤。少量DMSO濃度誤差可作為稀釋熱被觀測而隱藏欲檢測的相互作用熱。務必進行單一化合物稀釋熱測量，盡可能降低DMSO來源的熱量變化，以達成準確的樣品配製。

實驗例1： 使用ITC測量探索競爭式分析法^5）

在發現與創新藥物目標蛋白質特異性結合的小分子化合物上，對於蛋白質表面的全面化學空間探索是一種高效和有效的篩選手段。因此，正在受到關注的是相比於常見化合物庫平均分子量更小、300 Da以下的片段庫的創新藥物策略。儘管如此，由於這些片段化合物化學結構相對簡單，與蛋白質的結合親和性低，解離常數有時在數mM。因此，ITC因具備高靈敏度和既可進行物理化學性質分析的評估法，而被認為是有效的評估方法。如前述HIV蛋白酶抑制劑的例子特異性結合，經常觀察顯著的放熱反應和其反應收斂。此類輪廓示範氫鍵的形成預期。而在非特異性相互作用中，反應熱無收斂，在疏水互相作用時常見吸熱反應。基於此題，選擇在命中化合物中示顯放熱反應的化合物來做為強力的候選者。當目標蛋白質的結合點已明確，且已知結合物或小分子配基與該結合點的話，競爭測試是一種有效策略。通過ITC進行的競爭測試可進行精確的結合點特異性並示出放熱反應的命中化合物的篩選（圖2）。以下為筆者實踐進行的具體示例。

1. 目標蛋白質

以構類酮甾異構化酶（KSI）和3-氧-Δ5酮甾類異構化酶（3-氧-Δ5酮甾類異構化激發激素活性異構體的酶）為目標。

2. 小分子探索

以KSI為對象，從片段庫通過SPR篩選選擇了化合物。

3. ITC競爭測試（SITE）

在篩選得到的命中候選化合物中，使用ITC進行競爭測試以進行高效命中驗證。此分析技術是一種在目標蛋白質與篩選出的化合物共同存在的溶液中滴加已知的配基分的方法（圖2A）。當片段化合物與KSI在預定的結合點進行相互作用，則加入更高結合親和性已知的配基（deoxycholate: DOC）為陽性控制化合物，從而迫使片段化合物離開結合點以保持稳定。当片段化合物展現伴隨放熱反應的相互作用時，DOC結合伴隨的片段化合物解離顯示為吸熱反應。

為提升通量，此熱量變化中的競爭測試可以在單次滴加中評估，發展了SITE法（single-injection thermal extinction）。利用該SITE法對位於KSI上的片段化合物結合重新進行命中驗證。結果成功獲得了與KSI的基質DOC競爭且展現顯著放熱反應的焓驅動型命中化合物（圖2B）。此外，對關於MAPK信號通路之一的細胞內信號傳導途徑ERK2激酶蛋白類似地從片段篩選中獲取了化合物。

由此可知，ITC在不僅限於藥物的優化過程中，熱量評估在探索階段也表現出強大效果。一般來說，放熱反應，尤其是通常被認為創造了非共價特異性交互的氫鍵。然而理性設計氫鍵被認為相對困難。因此，當在藥物設計的初期階段中，尋找擁有氫鍵的低分子化合物進行合成展開是能導向高品質領先化合物的有效方案。

結論

本部分介紹了利用熱測試於低分子醫藥品開發中的相關研究例。低分子起始抑制劑的探索一般會指標高生物活性、抑制活性及高結合活性進行篩選。然而有時會忽略和未探知與標的分子的低分子藥物相互方式導致設計失敗，或在結構優化中得不到良好的結構功能相關性等問題發生。此外，近年來標的分子（主要為蛋白质）不僅侷限於酶和受体，还有膜蛋白且天然的去序蛋白等，这类生化性質對應較难標的也很多。当前标的分子愈加困难操作，处理不便利的标的分子很基本的心理预设是难以应对既有的药物探测框架与检测系。临界情况，抑制酵素的低分子化作物无法与明確的酶底袋结合位往往也没有，必然后作用于组装界面如蛋白裂蛋白质的界面等。这类性質也增加特殊性。异常体验到标的蛋白质可选取特异性结合的识别技术高敏感并可进行定量解析的探测技术不可缺。以上即多重议题存在的分子标的处方中重点关联救标的分子药物结合高亲和特异性为何不可分，以及精确探测和解析技术需求提升及展开本项认为有用的ITC。本項雖不例举详情，其他IBT助于低分子抑製劑搜尋例如瘧疾及癌症為目標的組氨酸酯酶(SHMT)受到關注的低分子抑製劑篩選中導出的方法7）來明ITC溫度周特性之特異性，並且可能導向合理的結合構設計。在結合與結構優化，結構化分析的基礎上，合理設計可得出期望的分子特異性。

◆ 文獻
1） Ohtaka H & Freire E：Prog Biophys Mol Biol, 88：193-208, 2005
2） Muzammil S, et al：J Virol, 81：5144-5154, 2007
3） Carbonell T & Freire E：Biochemistry, 44：11741-11748, 2005
4） Kawasaki Y, et al：Chem Pharm Bull (Tokyo), 62：77-83, 2014
5） Kobe A, et al：J Med Chem, 56：2155-2159, 2013
6） Tashiro S, et al：ACS Chem Biol, 13：2783-2793, 2018
7） Nonaka H, et al：Nat Commun, 10：876, 2019

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