蛋白質電泳迁移率的測量-Zetasizer Nano ZSP

利用Zetasizer Nano ZSP進行蛋白質電泳迁移率的测量 

 

 

序论  

 


   Zetasizer Nano是动态光散射和电泳光散射技术领域的市场主导产品，用于流体力学尺寸和电泳迁移率的测量。 

 

   动态光散射（DLS）是一种广泛用于分析蛋白质及其制剂特性的技术。通过这种方法，不仅能够测量分子大小，还可以评估其稳定性。  

 

   最近，随着蛋白质作为生物治疗剂的使用迅速增加，溶液中蛋白质的稳定性引起了科学和商业上的极大关注。由于识别制剂的稳定性和行为对于开发安全且可商业化的产品至关重要，因此对分析这些特性的工具的需求正在增加。 

 

   通过电泳光散射（ELS）测量的蛋白质迁移率是确认制剂行为和粘度稳定性的特征指标之一[1]。
 

   实验上，蛋白质迁移率测量提出了两个实际挑战。 

 

(i) 处理蛋白质溶液通常涉及处理被稀释的浓度。DLS这个术语包括处理与少量小分子的大小成比例的低水平散射光。迄今为止，大多数基于光散射的设备缺乏这种测量所需的灵敏度。 

 

(ii) 测量蛋白质迁移率需要将电场施加到样品上，这是一种可能会促进聚集并对蛋白质造成损害的物理处理[2]。结果是，迁移率测量结果反映的是分子的聚集现象，而不是待测蛋白质。 

 

为了精确测量蛋白质迁移率，需要满足以下三个要求。
1. 具有足够灵敏度的设备，以便测量与蛋白质稀释液相关的低电泳迁移率和低计数率
2. 降低聚集发生风险的测量技术
3. 能够识别并将聚集情况最小化的智能自动化测量流程  

   Zetasizer Nano ZSP（ZSP，图1A）和相关软件专门为满足这些要求而开发。在ZSP的灵敏度帮助下，即使是像溶菌酶这样的低浓度限制例如1mg/mL样品的迁移率测量时，也能对其进行小尺寸颗粒及低浓度样品的分析。此外，ZSP中使用的相位分析光散射（PALS）技术增强了低迁移率样品的测量性能，例如蛋白质。  

 

   Malvern Instruments的科学家们发现电泳测量过程中的许多聚集现象发生在电极上。通过采用Malvern Instruments发明并申请专利的扩散屏障方法（图1B），可以保护蛋白质样品免于电极创建聚集 [2, 4]。 

 

   这意味着可以施加更长的电压来从仪器获得更可靠的数据[3]。扩散屏障方法参考了最新的关于纳米大小生物材料的迁移率测量的ASTM标准[2]。 

 


   Zetasizer Nano ZSP的Zetasizer软件还包括蛋白质迁移率测量的专用协议。这些测量通过降低电压和谨慎控制单元内温度来避免样品聚集，从而防止聚集发生。 

 

   在迁移率测量的前后，系统使用完全相同的光学设备来测量尺寸（图2）。因此，测量的粒度分布直接反映了迁移率的测量群体。如果测量尺寸时使用了与测量迁移率时不同的光学设备，可能会导致光散射强度变化，并可能无法识别形成的聚集体，因此建议使用相同的光学设备进行尺寸测量。通过在迁移率测量前后使用相同的光学设备进行尺寸测量，Zetasizer Nano ZSP可以识别在测量过程中可能发生的任意聚集现象。 

 


   最后，通过精确测量蛋白质的电泳迁移率，可以基于已知的蛋白质迁移率与电荷之间的关系计算蛋白质的电荷[5]。 

 

   利用Zetasizer软件的新型计算器选项，可以进行计算。在本应用笔记中，将详述使用ZSP测量蛋白质迁移率的过程。通过ZSP的灵敏度、扩散屏障方法的高效执行以及适当的测量协议，可以获得尽可能准确的测量值。
 

方法
 

   通过使用两种缓冲液（buffer）制备人血清白蛋白（HSA），最终得到约2mg/mL的浓度。使用的缓冲液条件如下。 

 

 1）蛋白质原本溶解的pH7缓冲液， 2）pH4.3的柠檬酸盐缓冲液（citrate buffer）。在开始测量之前，采用0.02μm的滤膜过滤样品以消除聚集体的影响。 

 

   使用扩散屏障方法防止与电极接触引起的样品聚集。使用一次性折叠毛细管池（disposable folded capillary cell）装入适量的缓冲液。利用凝胶加载移液管（gel loading pipette）的尖端，将20μL的HSA（2mg/ml）加载到池底的光路中。将池放入设备后，开始测量尺寸和ζ电位。 

 

   HSA的流体动力学尺寸和迁移率通过Zetasizer Nano ZSP利用DLS和ELS分别测量。为了确认测量的ζ电位确实归属于蛋白质而非聚集物，流体动力学尺寸和迁移率均在相同的散射角进行测量。 

 


结果 

 


    

   图3A和3D显示了实验开始时在pH 7和pH 4.3下测量的样品尺寸分布。正如预期的那样，只存在一个单一的峰值。pH 7时，尺寸为3.8nm，与已报道的HSA数据匹配良好。 

 

   有趣的是，pH 4.3时，尺寸为4.1nm，比pH 7时稍大。无法仅通过这种技术判断这是由于结构变化、较高水平的寡聚态还是部分聚集的早期迹象引起的。 

 

   随后，进行样品的迁移率测量并计算结果。图3B和3E显示了迁移率测量的频率图。研究频率图是评估测量质量的好方法[6]。 

 

   由于蛋白质尺寸小，因此扩散速度极快。在电泳测量过程中，蛋白质处于电泳态，但扩散速度未被电泳完全克服。 

 

   结果是，散射光的频率偏移包括显著的扩散成分，因此显现为宽峰值。由于聚集物更大，含有聚集物的样品的频率图显示更小的扩散成分，因此具有更高而尖锐的峰值。这些在应用笔记MRK1651-02和参考文献[4]中更详细讨论。在此情况下，频率图具有宽且平的峰值，说明测量主要针对蛋白质而非聚集物。
 

   pH 7时，测量的HSA电泳迁移率为-0.88±0.2μmcm/Vs，而在pH 4.3时为0.44±0.2μmcm/Vs。通过这些结果可以确认样品的等电点位于两个pH值之间。 

 


   一旦测得电泳迁移率，可以使用Zetasizer软件的新计算器从测得的流体动力学尺寸和电泳迁移率计算蛋白质总电荷。图4显示pH 7下计算的HSA电荷约为-18，而pH 4.3时计算的电荷大约为+10。 

   图3C和3F显示了迁移率测量后样品的尺寸分布。结果表明测量过程中仅发生少量聚集现象。在两种情况中，主峰在pH7时主导了99%的散射光，而在pH4.3时主导了样品的90%。

 

   因此，可以信任这些迁移率得出的结果。pH 4.3的样品在无电场时随时间推移发生了聚集，它可能由低pH诱导。这种效应也解释了测量过程中发生的少量聚集。

 


讨论 

 


   总体结果展示了与已知值相似的迁移率测量。此外，测量的蛋白质迁移率在低pH值下更加显著。测量的重复性和出色性增强了结果的准确性，这是通过后续的DLS测量中宽阔的频率图和最小水平的聚集现象验证的。
 

   计算的蛋白质电荷与Tanford的研究进行了比较[2]。Tanford证明在pH7时HSA具有约-16的电荷量，这与此处报告的测量良好匹配。在pH4.3时，电荷量约为+20。 

 

   这一点比此处介绍的数据更为确凿。可能的原因包括实验中使用的缓冲液和HSA来源，但整体数据一致性可以通过参考文献[6]得到明确解释。 

 


   利用Zetasizer Nano ZSP和软件以及扩散屏障方法，确保在实际测量过程中获得可靠且精确的测量结果。通过三种方式实现了这一点： 

 


   1. 扩散屏障方法防止蛋白质样品在电极上聚集。
   2. Zetasizer软件将用户输入最小化、提高测量准确度，通过优化和自动化蛋白质尺寸和ζ电位的测量。
   3. 由于Zetasizer Nano ZSP使用高灵敏度的相同光学设备测量尺寸和ζ电位，向用户提供测量准确度的信心。 

 


   综上所述，通过使用pH7和pH4.3缓冲液成功测量了2mg/mL浓度的HSA迁移率。由于扩散屏障方法所需的蛋白质样品量很少（在此仅20μL），因此可在最低成本的样品下实现这些测量。 

[1] Laue, Proteins in Serum – Colloids vs molecular views, presentation at Colorado Protein Stability Conference, 2011
[2] ASTM2865 – Standard guide for measurement of electrophoretic mobility and zeta potential of nanosized biological materials
[3] Corbett, Connah & Mattison, Electrophoresis. In press 2011
[4] Corbett, Connah & Mattison, Patent Pending
[5] Loeb, A.L, Wiersema, P.H. and Overbeek, (1961) “The Electrical Double Layer around a Spherical Colloid Particle” MIT Press, Cambridge Mass
[6] Corbett & Jack, Colloids & Surfaces A: Physiochemical and Engineering Aspects. (2010) 376 pp31-41