通往卡洛里計大師之路 Vol.8 用DSC測量RNase A！第二部分

經過 Malvern Panalytical, Thursday, 7th April 2016

通往卡洛里計大師之路 Vol.8
用DSC測量RNase A！第二部分

出現於此的人物和故事均為虛構。
技術內容由大阪府立大學客座研究員深田教授提供指導。

透過頁面底部的「下載」按鈕，
可以下載在正文中出現的VP-DSC解析步驟。

第二天早上，仲村到達實驗室時，系統剛完成第10次掃描，溫度正在下降。

控制測量的基線很穩定。在約30℃時卸下壓力蓋並加注樣品。使用ThermoVac進行樣品的脫氣，然後將壓力插頭設置到壓力傳感器上。本次未使用填充漏斗，而是用帶有Luer蓋針筒的針頭，注意不要碰到底部，輕輕插入樣品池，排出樣品池的緩衝液。脫氣樣品的充填完成，預檢冷藏的15分鐘結束，進行最終平衡。DP值接近零，狀態良好！

仲村，進展順利嗎？

	是的，DP值看起來沒有問題，現在只需等待測量結果。

對了，有改變掃描次數嗎？

	啊，我忘記了，把數字改為11，然後點擊更新運行參數。險些出錯。

	在測量開始後更改也可以，只是仍要小心在數據獲取中可能發生的問題。

我會銘記於心。

測量結束後，在Origin7.0實時繪圖中點擊完成掃描按鈕顯示以下數據。

	仲村，獲得了不錯的數據。

謝謝。但是，基線略微向右上升。之前在水-水測量中也是如此，這沒問題嗎？

	該斜率可以認為是樣品池和參考池的體積不是完全一致而導致的系統偏移。在DSC實驗中，基本上需要從樣品測量數據中減去控制測量數據，如果系統一樣偏移，就不會影響最終結果。

換句話說，數據好壞取決於基線斜率的匹配。

	就是這樣。

若斜率不匹配可能是氣泡進入到測量池的緣故？

	正是如此。如果基線重複性差，首先應懷疑氣泡。導致氣泡的原因可能是測量池不乾淨。

	無論是ITC還是DSC，保持池內潔淨是關鍵！

	是的，保持池內潔淨非常重要。此外，若緩衝液的成分有所不同，也會導致基線的偏移，要注意這點。

	還有一點，樣品的響應線要低於控制的響應線。這次也是這樣的。

是的，但為什麼是這樣呢？

	與控制，即緩衝液與樣品溶液比較中，因為樣品含有蛋白質，因此水分子的摩爾濃度較低。相對於蛋白質，水的比熱容量較高，含量越高，釋放的熱量就會越高。

是這樣的。如果樣品的響應值較高會怎樣呢？

	這可能是在緩衝液的成分出現輕微不一致時發生的。

	那麼將系統洗淨並關閉。

謝謝，接下來是分析。

	是的，先按手冊說明完成。

哦，桌面上沒有這個圖標……

	根據購買時的應用範疇不同，可能桌面上沒有見到MicroCal, LLC DSC的圖標，但有MicroCal Analysis Launcher圖標。出現這一情況時，雙擊此圖標，並從MicroCal Data Analysis Click button to Start中選擇VP-DSC。後續操作可按手冊進行。

說起來，控制數據有10次掃描，不知道應該選哪一個？通常應該用最接近樣品測量的控制數據吧。

仲村，你有什麼問題嗎？

我有10次控制掃描數據，在這種情況下，應該用最接近樣品的第10次掃描嗎？

是的。重複掃描次數越多，數據才會重現性越好，這種情況下第10次掃描數據最合適。當然，如果最後一次控制測試數據有峰值噪聲，需要選擇之前的一組備用。

	明白了，謝謝。那麼樣品用第11次掃描，控制用第10次，這樣請調用兩份文件。

	註：在分析軟件中雖然標記為Kcal/mole，實際應為kcal/mol。

仲村，看來分析也沒問題。

是的，但ΔH出現了兩次。它們都相似，應選擇哪一個呢？

仲村，這正是你之前有意見的地方。

？？？

差異在於卡路里量熱變化（ΔHcal）和范特霍夫焓變化（ΔHvh）。

	哦，我忘了！

ΔH標記上帶有v的是范特霍夫焓變化。由於所獲得的數據類似，顯示RNase A是一個雙態轉變的蛋白質。

理解。對於這樣的樣品，分析可適應雙態模型。

	教授，Test Kit有標註「數據分析方法：從0積分」，這是什麼意思？

分析軟件中的一個功能，是在基線扣除後，使用峰值的信息來計算焓變化和Tm。

	補充說明。從0積分未在日文簡易手冊上列出。在進行擬合分析前編輯數據，操作仍與扣除基線部分一致。此後操作如下所示。

哦！？Tm和NDH的值與擬合時不同

	從0積分的Tm是找到峰值的頂點位置，而擬合來自計算所獲得的面積一半的溫度，NDH類似。從0積分是真實面積，而擬合獲得的則是紅線數據下的部分面積，因而略有偏差。檢查擬合曲線，實測值與擬合曲線會有所不一致。