卡路里計大師之路 Vol.2(續) 使用等溫滴定式卡路里計 iTC200 吧!

卡路里計大師之路 Vol.2 續
使用等溫滴定式卡路里計 iTC200 吧!

※文章的最後可以下載資料。

仲村先生終於來到深田教授的辦公室。
深田教授!好久不見!!您還健康嗎?

謝謝您這次的指導。請多關照。

仲村先生,您會來,真是太好了。我等你很久了。距上次見面已經有幾年了吧?呵呵。聽說您要使用ITC和DSC了。

是的,就是這樣!請多多指教。我記得在我作為學生時,就知道教授您在做這些測量,但沒想到自己也要做測量。
呵呵,是嗎。那麼,從哪裡開始呢?

我在公司使用iTC進行測量,但效果不佳……因此,我整理了一些問題。
哇,準備得真好。那麼,請讓我看看。
深田教授正在查看仲村先生的筆記。
仲村先生,您有很久沒使用這個系統了嗎?

可能樣品槽裡還殘留著髒物。
DP較高,基線噪音水平增加,這是其徵兆。
替換對照槽中的水後也沒有改善嗎?
首先,我建議您進行徹底清洗。
另外,將來清洗也非常重要。
我自己測量每次都會用洗潔劑和超純水清洗槽和注射器。
所以,DP比reference Powder高的原因不是因為氣泡,而是因為
樣品槽髒了,對吧?

我想就是這樣吧。可以用20 % Contrad 70或14 % Decon 90對槽進行加熱清洗。我記得說明書裡有提到。

啊,是這個吧!(手冊P41及(註1))

(註1)使用VP-ITC的人,請參照手冊P.45。若要更改夾套溫度,請在Thermostat/Calib.標籤中的設置點(℃)輸入溫度,然後點擊設置夾套溫度。
教授,如果DP值偏低,是不是因為氣泡進入了樣品槽,怎麼才能防止氣泡進入呢?
當注入溶液時,在注射器內取稍多一點(350 μL)的溶液,將針頭盡量靠近槽底,並緩緩注入。這樣通常沒有問題,但若是少量溶液,比方說,約50 μL,則需通過泵送在槽內產生對流來排出氣泡。
槽與管道之間的液量大約為50 μL,所以若超出進行泵送,則可能會重新進入氣泡,需留意。
此外,注射器在槽內上下緩慢移動,有助於排出於槽與管道交界處滯留的氣泡。
最後,很重要的一點!若溶液的溫度低於測量溫度,請提前返回測量溫度。據廠商稱,iTC200倒不需要進行樣品的脫氣(注2)。
隨著不斷測量,您會掌握技巧,請耐心堅持。
(注2)使用VP-ITC的用戶需進行脫氣後再測量。

關於參考槽,為什麼用超純水沒問題呢?通常實驗時應該配制緩衝液啊。
參考槽需要加入與樣品槽熱容相同的溶液,以消除外部的溫度波動。
水的熱容非常大,而且溶液中含量最高的也是水,所以參考槽用水就可以。
參考槽的水一週更換一次就行,不過,由於微量蒸發,若連續進行高溫測量,則需再次更換等。

仲村先生的疑問無窮無盡,這裡無法一一介紹,請從下文對於仲村問題的深田教授解答中進行資料下載。

教授,最後還可以問一個嗎?

不止一個,您可隨時發問。
感謝!實際測量樣品時的濃度設置問題,如手冊所述基於C值等等,但不太有概念。

補充說明。C值是指在進行分析時尋找良好S型曲線所需的細胞樣品濃度。

iTC200隨配的控制軟件中含有模擬軟件,因此可以方便地進行參數設置。

但在一般情況下,蛋白質濃度通常約為10 μM,但需根據結合強度的不同進行調整。
根據C值來設置濃度,如果是高親和力的相互作用時,測定槽濃度非常低。
以解離常數為10 nM的樣品為例,若想將C值控製在5,

可以推算出測定槽濃度為50 nM。
不過,要在該濃度進行測量時,可能無法得到足夠的熱量,最好保持至少1 μM(注3)。
ITC測量中,準確的濃度信息也非常重要,但這需要接下來的討論,此時起碼通過280 nm附近的紫外光吸收譜來確定蛋白濃度。
那麼實際測量一下。先用CaCl2和EDTA試驗。

(注3)由於相互作用源的熱量變化各有不同,1 μM時有時足夠,若變化小,則需要提升測定槽濃度。

仲村先生在深田教授的守護下,開始進行ITC測量練習。
下一次,我們將實際查看測量數據,學習查看數據的要點,以及發生問題時的應對方法。敬請期待!
【博客後記】
在撰寫本文的過程中,為使其更貼近現實,特意去觀察深田教授進行ITC測量。
當時使用的是1987年首次發售的OMEGA系統。約30年前的系統仍能正常運行真是驚人。我當時是第一次看到正在運行它的樣子。使用的電腦是Windows 3.1 !?當然沒有USB端口。但最讓我震驚的是,系統的槽從未出現故障,唯一修理過的是攪拌馬達和PC板子。
深田教授是系統的理解者,他創造了未在手冊中規定的獨特用法。當然在測量後他進行徹底清洗作業。
以教授給出的知識為基礎,往後也會繼續為大家更新信息。


關於MicroCal ITC的歷史,請參閱位於英國的馬爾文總部的博客。馬爾文總部的博客 請點一下這裡閱讀material talks!

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