GPCR 的鍵結動力學

簡介

G 蛋白質耦合受體 (GPCR) 包含一大類別的整合膜蛋白，這對血漿薄膜上細胞外的刺激傳導來說非常重要，以產生分子和細胞反應。它們可調節真核細胞中各種生理過程，並代表最大族群的治療標的物，其中有超過 30% 可用於製藥標的 GPCR。

膜蛋白相當難以研究，因其需要仿似膜一般的環境且當其自細胞膜萃取後便會變得不穩定。在這裡，我們展示了 Creoptix WAVE 以最高解析值針對神經調壓素受體 1 (NTSR1)¹的熱固定變異體測量胜肽配體促進劑 (NTA11) 交互作用之能力。此 GPCR 可調節神經調壓素的多種功能，例如低血壓、高血糖、體溫過低、抗傷痛覺以及腸道活動和分泌之調節²。

材料與方法

受體是透過 avi 標記於活體內進行生物素化，隨後在預先以卵白素塗層的感測器 (WAVEchip DXH-STA) 上擷取。針對測得的胜肽促進劑，使用突變且截斷形式之神經調壓素 (Mw 725 Da)，其是由殘留物 8-13 及 Y11A 替代物所組成。記錄 3 倍連續稀釋的 7 個不同分析物濃度之劑量反應曲線，其中 300 nM 為最高濃度。流動速率設定為 30 μL/min。電泳緩衝液為 pH 值 7.5 的 5 0 mM Tris、150 mM NaCl 及 0.1% (w/v) 的洗滌劑 lauryl maltose-neopentyl glycol (L-MNG)³。所有測量均在 25°C 下進行。

結果

純化及生物素化神經調壓素受體在預先以卵白素塗層的感測器 (WAVEchip DXH-STA) 上擷取，密度為 1350 pg/mm²。記錄了胜肽促進劑鍵結的藥物反應曲線 (圖 1)，產出可擬合 1:1 交互作用模型的鍵結數據，包括質量傳輸 (MTL)。表 1 為取得的動力學速率和平衡常數。

圖 1：作為分析物的修飾神經調壓素胜肽 (MW 725 Da) 與作為配體的熱固定神經調壓素受體 (NTSR1，70 kDa 蛋白質/洗滌劑混合) 之間交互作用的感應圖。數據以 1:1 交互作用模型擬合，其中包括使用 WAVEcontrol 軟體進行質量傳輸限制 (MTL)

表 1：使用 1:1 交互作用模型取得 NTA11 促進劑的動力學速率及解離常數，包括質量傳輸限制 (MTL)

參考文獻

1. Egloff, P., Hillenbrand, M., Klenk, C., Batyuk, A., Heine, P., Balada, S., Schlinkmann, K. M., Scott, D. J., Schütz, M., and Plückthun, A. (2014) Structure of signaling-competent neurotensin receptor 1 obtained by directed evolution in Escherichia coli.Proc.Natl.Acad.Sci.U. S. A. 111, E655–62.
2. Krumm, B. E., and Grisshammer, R. (2015) Peptide ligand recognition by G protein-coupled receptors.Front.Pharmacol. 
3. Chae, P. S., Rasmussen, S. G. F., Rana, R. R., Gotfryd, K., Chandra, R., Goren, M. a, Kruse, A. C., Nurva, S., Loland, C. J., Pierre, Y., Drew, D., Popot, J., Picot, D., Fox, B. G., Guan, L., Gether, U., Byrne, B., Kobilka, B., and Gellman, S. H. (2010) Maltose-neopentyl glycol (MNG) amphiphiles for solubilization,  stabilization and crystallization of membrane proteins.Nat. Methods 7, 1003–1008.