Grundprinzipien der Nanopartikel-Tracking-Analyse – Q&A

NTA liefert eine zahlenbasierte Verteilung, da es sich um eine Analyse Partikel für Partikel handelt. DLS liefert natürlich eine intensitätsgewichtete Verteilung, die in volumenbasierte und dann in zahlenbasierte umgewandelt werden kann. In den ASTM-Leitfäden gibt es spezifische Hinweise, dass die aus DLS abgeleitete zahlenbasierte Verteilung großen Ungenauigkeiten unterliegt und nicht für den Routineeinsatz empfohlen wird. NTA ist von Natur aus eine zahlenbasierte Technik, sodass dasselbe Muster bei diesen beiden Techniken etwas unterschiedliche Ergebnisse zeigen kann.

Sehen Sie sich unsere technische Notiz über den Vergleich statistischer Maße, die durch NTA- und DLS-Techniken berichtet werden an.

Wir haben auch ein Whitepaper zum Vergleich der NTA- und DLS-Ergebnisse über eine Reihe von Probentypen. Dies sollte eine bessere Vorstellung davon geben, wie beide Techniken zueinander passen.

NTA passt die Daten nicht an eine bestimmte Spitzenform an, passt die Größenverteilungen nach der Analyse nicht an oder beeinflusst nicht verschiedene Teile des Größenbereichs. Die Histogramme sind nur eine Darstellung aller einzelnen Partikel, nachdem ihre Größe analysiert wurde. Da unsere Basisdaten eine Population einzelner Partikel sind, sind alle statistischen Maßnahmen einfache Populationsstatistiken und keine Interpolationen aus einer abgeleiteten Verteilung.

Eine Verdünnung wird höchstwahrscheinlich erforderlich sein, es sei denn, Sie haben eine Probe, die von Anfang an sehr dünn ist. Wenn Sie mit DLS-Messungen vertraut sind, sind wir normalerweise 10-1000x mehr verdünnt als das. Ideal im Bereich von 10^7 bis 10^9 Partikel/ml.

Emulsionen im submikronischen Größenbereich sind für diese Technik sicherlich geeignet. Solange die Proben mit einer geeigneten Flüssigkeit verdünnt werden, die die Stabilität der Tropfen erhält, sollte die Messung ziemlich einfach sein.

Proteinmonomere liegen weit unterhalb der unteren Nachweisgrenze dieser Technik, aber das Überwachen von Proteinaggregation ist eine starke Anwendung für diese Instrumente, da sie Polydisperse Verteilungen handhaben können und eine Konzentration der gemessenen Aggregate bereitstellen. Unsere Anwendungshinweise zur Proteinaggregation sollten weitere Informationen liefern.

Die Natur der Messung liefert den hydrodynamischen Durchmesser, was die Größe des Objekts bedeutet, das sich in der Flüssigkeit bewegt. Wenn etwas von signifikanter Größe zur Oberfläche des Primärpartikels hinzugefügt wird, beeinflusst es die Bewegung des Partikels in der Flüssigkeit, daher die gemeldete Größe. Das Hinzufügen von Tensiden oder Antikörpern zur Oberfläche des Partikels sollte ausreichen, um eine Verschiebung der gemeldeten Größe um einen Betrag gleich der Größe der angehängten Moleküle zu zeigen. Größenverschiebungen von nur drei Nanometern wurden in einigen beschichteten/unbeschichteten Experimenten zuverlässig beobachtet.

DLS und NTA/NanoSight werden auf die gleiche Weise reagieren, da die Brownsche Bewegung, auf der beide Techniken basieren, gleichermaßen beeinflusst wird. NTA könnte etwas zuverlässiger darin sein, diese Verschiebung zu zeigen, da es die Primärpartikel genau messen kann, unabhängig davon, was sonst in der Probe sein mag.

Eine weitere Technik, die für diese Anwendung in Betracht gezogen werden könnte, ist die Resonanzmassenmessung (RMM), wie sie in Malverns Archimedes Produkt verkörpert ist. Wenn die Primärpartikel im Messbereich der Technik liegen, bedeutet die Massensensitivität dieser Technik, dass die Verschiebung durch die Beschichtung leicht gemessen werden kann.

Die Stokes-Einstein-Gleichung erfordert die Eingabe von Temperatur- und Viskositätsvariablen. Für jeden wasserbasierten Verdünner kann die Viskosität automatisch aus der temperaturabhängigen Wertetabelle übernommen werden. Die Temperatur wird in der Probenzelle gemessen und bei den meisten NanoSight-Modellen automatisch in die Software eingelesen. Daher muss der Benutzer keine Werte manuell eingeben, es sei denn, der Verdünner unterscheidet sich erheblich von Wasser.

Der Vergleich zweier unterschiedlicher Techniken könnte viele Seiten füllen, aber ich werde die wesentlichen Unterschiede zusammenfassen. Noch wichtiger ist, was Sie über Ihre Probe erfahren möchten und welche Technik dafür am empfindlichsten ist.

NTA und TRPS werden oft zusammen betrachtet, weil sie ähnliche Messbereiche und Parameter haben. NTA hat eine niedrigere Nachweisgrenze, sodass sie die vollständige Größenverteilung für Proben sehen kann, die weit unter 100 nm reichen. NTA erfordert keine starke Elektrolytlösung, die die Stabilität einiger Proben beeinträchtigen könnte. Proben können in jedem wasserbasierten Verdünner oder einer Vielzahl von organischen Lösungsmitteln gemessen werden. Die TRPS-Sensorikpore muss für genaue Ergebnisse häufig kalibriert werden und ist anfällig für Verstopfungen. Da jedes Partikel nacheinander gezogen wird, hat es das Potenzial, eine Technik mit höherer Auflösung zu sein. NTA ist im Allgemeinen flexibler, hat ein breiteres Anwendungsspektrum, ist viel schneller und reproduzierbarer im praktischen Einsatz, hat die Fähigkeit, im Fluoreszenzmodus zu arbeiten, und wird aufgrund dieser größeren Möglichkeiten in der wissenschaftlichen Gemeinschaft breiter akzeptiert.

Wenn Sie diese Techniken in Betracht ziehen, würden wir uns freuen, ein paar Proben zu testen, um zu zeigen, wozu das System in der Lage ist. Alle Techniken haben Stärken und Schwächen, wie durch die Bandbreite der Techniken in Malverns Portfolio belegt wird.

Vielleicht ist es ein wenig haarspalterisch, aber NTA ist keine Technik, die kalibriert werden muss. Es sollten routinemäßig Standards durchgeführt werden, um den ordnungsgemäßen Betrieb zu überprüfen und gelegentlich Drift abzufangen. Wenn diese Ergebnisse außerhalb der Spezifikation liegen oder Drift zeigen, wenden Sie sich an Malverns Support Desk. Greifen Sie auf die detaillierte Prozedur für die am häufigsten verwendeten Polystyrol-Latex-Standards zu.

Ja, das NanoSight NS500 Modell hat die Fähigkeit, das Zeta-Potenzial für jedes Partikel einzeln zu messen. Unsere technische Notiz bietet einige Details zum Prozess. Wenn Sie einzelne Komponenten in einem gemischten Material charakterisieren oder wenn das Zeta-Potenzial verwendet wird, um eine Änderung in der Probe zu charakterisieren, kann dies eine wertvolle Alternative zur traditionellen elektrophoretischen Lichtstreuung des Zeta-Potenzials sein, wie in Malverns Zetasizer Modellen verwendet.

Die einfache Antwort ist, welche Einstellung wird es den Partikeln ermöglichen, 5-10 Sekunden im Sichtfeld zu bleiben. Dies hängt davon ab, welches Modellgerät und welche Topplatte verwendet werden. Mehr Details und empfohlene Geschwindigkeitsbereiche finden Sie in unserer technischen Notiz über Flussmodus-Analysen.

Ich habe mit verschiedenen Ton- und Umweltproben gearbeitet. Bei den vielen Umweltwasserproben werden die Proben oft so gemessen, wie sie ankommen, normalerweise mit einem Verdünnungslevel. Wenn Sie von irgendeiner Art von Trockenpulver ausgehen, ist normalerweise etwas Aufwand erforderlich, um sie in eine Flüssigkeit zu dispergieren, um zu den Primärpartikeln (nicht Agglomeraten) zu gelangen. Einige Tenside wären erforderlich (z.B. Natriumpolymetaphosphat) und mechanische Energie wie Sonikation. Je nachdem, Ihr Ziel (Agglomerate oder Primärpartikel zu messen), entscheidet, welcher Strategie Sie folgen und wie viel Energie Sie aufbringen möchten.

Die NanoSight-Probenkammer ist geschlossen, sodass die Verdunstung/Ausfällung extern gemacht werden müsste, dann in die Probenzelle injiziert werden. Messungen können in wenigen Sekunden erfolgen, wenn Sie nur eine schnelle Größenabschätzung benötigen. Vom Reaktionsgefäß zur Messkammer ist es nur eine Frage des Beladens einer Spritze und des Einführens, sodass eine schnelle Antwort möglich ist.

NTA kann die Form des Partikels nicht sehen. Alle Partikel erscheinen als Lichtpunkt und das System analysiert nur die Bewegung dieses Lichtpunkts. Ein Partikel mit hohem Seitenverhältnis könnte einen Lichtpunkt erzeugen, der nicht perfekt rund ist, aber es dreht/tummelt auch und fluktuiert, sodass keine konsistente Information vorliegt, mit der gearbeitet werden kann. Der Ausgang ist ein äquivalenter Spektraldurchmesser, also eine Sphäre, die ein äquivalentes Volumen des gemessenen Partikels hat. Wenn zwei Stabmuster unterschiedlicher Längen gemessen werden, würde der äquivalente Spektraldurchmesser eine Differenz relativ zur Differenz im Partikelvolumen zeigen.

Sphären und Stäbe können in einer Probe zusammen gemessen werden, aber der einzige Weg, sie zu unterscheiden, wäre, wenn die beiden äquivalenten Kugeldurchmesser ausreichend unterschiedlich voneinander sind.

Um die Viskosität zu ändern, öffnen Sie die Dateien, die Sie ändern möchten. Sie sollten wie unten in Blau hervorgehoben sein. Klicken Sie auf Einstellungen ändern>Viskosität, deaktivieren Sie das Kästchen, dann doppelklicken Sie auf die Stelle, wo jetzt WASSER im Bild steht. Sie können dann die Viskosität in cP eingeben. Klicken Sie auf Aktualisieren und es sollte neu verarbeitet werden und die angepassten Daten anzeigen. Sie müssen Ergebnisse exportieren, wenn Sie aktualisierte Tabellenkalkulationen oder PDF-Berichte wünschen.

Von den zusammenfassenden Tabellenkalkulationen, die wir exportieren, fügen Sie einfach>Graph>Liniendiagramm ein, wählen Sie dann die ‚Konzentration‘-Spalte als die tatsächlichen Daten. Der mittlere Bin wird die x-Achsenbeschriftungen sein.

Der korrekte Erkennungsschwellenwert hängt vom Probentyp und davon ab, wie das Video aufgenommen wurde. Wenn Sie die Kamerastufe so einstellen, dass alle Partikel sichtbar sind, aber die größten Partikel nicht gesättigt sind (wenn dieser Kompromiss möglich ist), führt das normalerweise dazu, dass die Analysen mit dem Standard-Erkennungsschwellenwert von 5 durchgeführt werden.

Die Logik ist, den Schwellenwert so niedrig zu halten, dass alle Partikel mit dem roten Kreuz markiert werden, aber nicht so niedrig, dass Sie optisches Rauschen und Hintergrundeffekte markieren. Die folgende Abbildung ist aus dem Handbuch und illustriert diese beiden Seiten der Thematik.

Um ein gutes Gefühl für den Effekt der Änderung des Erkennungsschwellenwerts zu bekommen, nehmen Sie ein Video und analysieren Sie es immer wieder mit unterschiedlichen Erkennungsschwellenwerten. Bis Sie offensichtlich zu weit in eine Richtung gehen, ändern sich die Ergebnisse nicht massiv bei kleinen Differenzen in den Einstellungen. Die Möglichkeit, die verfolgten Partikel auf einem Bildschirm zu beobachten, sollte deutlich machen, wann wir Partikel verpassen oder Rauschen aufnehmen.

Wir haben keine dokumentierte Prozedur, aber ich empfehle diesen Blogpost.

DLS kann die meisten Materialien auf Größen unterhalb von 1 nm messen, aber NTA ist auch sehr fähig im<80 nm Bereich. Abhängig vom Brechungsindex des Materials könnte das untere Limit etwa 10 nm für Metalle, etwa 30 nm für Polymere und etwa 40 nm für Liposomen sein. Solange wir die Partikel sehen können, ist die Analyse dieses Bildes zur Größenbestimmung einfach und robust.

NTA kann keine Partikel innerhalb eines anderen Objekts sehen. Das zum Sehen der Nanopartikel notwendige Lichtstreuen wird von der Oberfläche der Zelle gestreut und dies wird das einzige sein, was die Kamera aufnimmt. Eine direkte mikroskopische Technik wäre erforderlich, um aufgenommene Partikel zu sehen.