Die beste GPC/SEC-Säulenkombination für Ihre Probe auswählen

Wenn Sie jemals mit GPC/SEC (z. B. OMNISEC) gearbeitet haben, wissen Sie, dass die gesamte Analyse von der Zusammenstellung der Säulenkombination abhängt. Und die Auswahl der passenden Säulen für Ihre Anwendung kann manchmal schwierig sein. Manchmal benötigen Sie für unterschiedliche Probenarten eine völlig neue Säulenkombination.

Es gibt viele Faktoren, die bei der Auswahl der besten Säulenkombination für Ihre Probe berücksichtigt werden müssen. Sie sollten den Bereich der Molekülgröße/Molekulargewicht, die mobile Phase, die Sie zur Lösung der Probe verwenden müssen, sowie die Kompatibilität mit der stationären Phase der Säule in Betracht ziehen. Bei der Verwendung mehrerer Säulen sollten Sie überlegen, ob sie einander ergänzen und in welcher Reihenfolge sie verbunden werden sollten.

In diesem Beitrag bieten wir Ihnen allgemeine Informationen über Säulen und Einblicke, wie Sie die beste Säulenkombination für Ihre Probe erstellen können. Die hier bereitgestellten Informationen beziehen sich hauptsächlich auf die Auswahl der besten Säulenkombination aus der Perspektive des Molekülgrößen-/Gewichtsbereichs. Informationen über Säulen für verschiedene mobile Phasenanalysen finden Sie in den verlinkten Beiträgen und in Webinaren.

Was passiert in einer Säulenkombination?

Beginnen wir mit einem kurzen Überblick darüber, wie die Trennung innerhalb einer GPC/SEC-Säulenkombination funktioniert. Wie auf dem obigen Bild zu sehen ist, wird ein gelöstes Gemisch aus zwei Proben unterschiedlicher Größe in die Säule eingeführt. Im Laufe der Zeit bewegen sich die beiden Probenfraktionen und das Lösungsmitte mit unterschiedlichen Geschwindigkeiten durch die Säule. Die größte Probe eluitiert zuerst (Population 2), gefolgt von der kleineren Probe (Population 1) und schließlich das Lösemittel.

Es ist wichtig zu verstehen, dass die Trennung nicht auf dem Molekulargewicht der Probe, sondern auf der Molekülgröße basiert!

Diese Trennung erfolgt, weil die stationäre Phase der Säule aus Gelpartikeln mit Poren besteht. Diese Poren sind groß genug, dass die Probenmoleküle beim Passieren der Säule in die Poren diffundieren können. Kleinere Moleküle diffundieren leichter in die Poren und verbringen mehr Zeit darin als Moleküle mittlerer und größerer Größe. Die größten Moleküle diffundieren nicht leicht in die Poren, daher durchlaufen sie die Säule auf einem einfacheren und schnelleren Weg.

Bei der Verwendung von GPC/SEC basiert die Trennung auf der Molekülgröße, wobei größere Moleküle zuerst eluieren, gefolgt von mittleren und kleinen Molekülen. Dieser Prozess wird anschaulich in der nachstehenden Animation dargestellt. Dabei eluieren zuerst große Dreiecke, die nicht viel Zeit in den Poren verbringen, gefolgt von mittleren Vierecken, und schließlich kleinen Kreisen, die leicht in die Poren eintreten können.

Mischschicht- und Einzelporengröße-Säulen

Die Unterschiede zwischen diesen beiden Säulentypen sind in diesem Beitrag ausführlich beschrieben. Kurz gesagt, Mischschichtsäulen enthalten eine stationäre Phase aus Gel mit einer Mischung aus Partikel- und Porengrößen, die eine Trennung über einen breiten Molekülgrößen-/Gewichtsbereich ermöglichen. Einzelporengrößen-Säulen enthalten ein homogenes stationäres Gel, das eine hervorragende Trennleistung über einen relativ begrenzten Molekülgrößen-/Gewichtsbereich bietet.

Wie man Säulen kombiniert zu einer Säulenkombination

Um eine Säulenkombination zu optimieren, müssen Sie möglicherweise zwei oder mehr Säulen kombinieren. (Aber wenn eine einzige Säule bereits die erforderliche Auflösung für Ihre Probe bietet, dann ist eine Kombination nicht erforderlich.) Dies spart Zeit und mobile Phase, was speziell für Proteine gilt. Während das Molekulargewicht von Proteinen einen breiten Bereich abdeckt, ist der Größenbereich aufgrund ihrer gefalteten Struktur enger als der von Polymeren.

Es gibt drei gängige Ansätze zur Kombination von Säulen zu einem Set. Diese Vorschläge sind nicht abschließend, können aber als Leitfaden dienen.

2 Mischschicht-Säulen: Die gebräuchlichste universelle Säulenkombination, die organische, wässrige und Spezial-Säulen umfasst. Zur Klarstellung verwenden wir zwei identische Mischbett-Säulen, z. B. zwei A6000M-Säulen für wässrige Analysen von Polysacchariden. Der Einsatz dieser Kombination maximiert die Abdeckung von Molekülgrößen-/Gewichtsbereichen und hält die Laufzeit unter 45 Minuten.

Kombination aus High/Low MW- und Mischschicht-Säulen: In Proben, die besondere extrem hohe oder niedrige Molekülgrößen-/Gewichtsarten wie Aggregate oder Oligomere enthalten, können wir eine zusätzliche high/low Einzelporengrößen-Säule verwenden, um die Trennleistung an den Enden des Molekülgrößenkontinuums zu verbessern, während die Mischschicht-Säule den Rest des Probenmaterials behandelt. Zur Verbesserung der Trennschärfe zwischen Proben- und Lösungsmittelpeaks kann eine low MW Säule hinter der Mischbett-Säule hinzugefügt werden.

Kombination mehrerer Einzelporengrößen-Säulen: Diese Strategie ist ideal, wenn nicht die gesamte molekulare Größen-/Gewichtsspanne, die Mischbetsäulen bieten, benötigt wird. Solche Säulenkombinationen sind nützlich in QC-Umgebungen, die ähnliche Proben überwachen, und maximieren die Auflösung im relevanten Größen-/Gewichtsbereich der Probe. Mehr als zwei Einzelporengrößen-Säulen, wie T5000 + T3000 + T1000, können kombiniert werden, um einen breiten Größen-/Gewichtsbereich abzudecken. Diese Kombination verlängert die Analysezeit, bietet jedoch eine verbesserte Auflösung.

Beim Kombinieren von Einzelporengrößen-Säulen ist es wichtig, sicherzustellen, dass zwischen den Größen-/Gewichtsbereichen keine Lücke besteht, da ansonsten das Risiko besteht, eine unterschiedliche Auflösung zu erhalten. Zur Veranschaulichung, wie in der obigen Kombination T5000 + T1000, könnte dies zu problematischen Peakformen und Artefakten im Chromatogramm führen.

Die Reihenfolge der Säulen

Viele von Ihnen fragen sich vermutlich: ‚In welcher Reihenfolge sollen die Säulen bei der Kombination angeordnet werden?‘

Unsere empfohlene Reihenfolge beginnt mit der Säule mit dem höchsten Molekülgrößen-/Gewichtsbereich und endet mit der Säule mit dem niedrigsten Bereich. Diese Reihenfolge ermöglicht es, dass die größten Moleküle mit der Trennung beginnen können, sobald das vollständige Probengemisch in das Säulenset eingeführt wird. Wenn die Säulen in umgekehrter Reihenfolge angeordnet sind, könnten die größten Moleküle durch niedrigere Molekülgrößen-/Gewichtssäulen gedrückt werden, wodurch die Diffusion von kleineren Molekülen behindert wird.

Deshalb haben wir im obigen Beispiel T5000 + T3000 + T1000 verwendet. Beim Kombinieren von Einzelporengrößen-Säulen mit Mischschicht-Säulen, fügen Sie die high MW Einzelporengrößen-Säule vor den Mischbettsäulen hinzu und umgekehrt, die low MW Einzelporengrößen-Säule nach den Mischbettsäulen.