Best Practices für die Differential-Scanning-Kalorimetrie von Proteinen und Biopolymeren

von Verna Frasca, Tuesday, 14th August 2018

In einem früheren Blog habe ich die besten Praktiken zur Erzielung von hochwertigen Daten mit einem MicroCal DSC besprochen. Hier sind weitere bewährte Verfahren für das MicroCal PEAQ-DSC System sowie die MicroCal VP-Capillary DSC und VP-DSC Systeme. Diese bewährten Praktiken gelten für die Analyse von Proteinen in Lösung und anderen Biopolymeren.

Probenerfordernisse:

Für hochwertige Differential-Scanning-Kalorimetrie (DSC) Daten müssen die Proben im gewünschten Puffer (pH, Salz, Hilfsstoffe usw.) vorliegen, und der abgestimmte Puffer wird in der DSC-Referenzzelle und für Puffer-Puffer-Scans verwendet.
Bereiten Sie die Proben im gewünschten Puffer durch Dialyse, eine Entsalzungssäule oder eine andere Puffer-Auswechslungstechnik vor.
Bewahren Sie den Puffer aus der Dialyse/Puffer-Austausch zur Nutzung für die Referenzzelle, Puffer-Puffer-Scans und Probenverdünnung auf.
Empfohlener Proteinkonzentrationsbereich von 0,1 mg/ml bis 2 mg/ml.
T_ms aus der DSC können konzentrationsabhängig sein.
- Für T_m-Screening und Vergleichbarkeits-/Ähnlichkeitsstudien stellen Sie sicher, dass alle Proteine in der Konzentration abgestimmt sind.

DSC-Einstellungen:

Bei der Verwendung der DSC für T_m-Screening und Vergleichbarkeits-/Ähnlichkeitsstudien stellen Sie sicher, dass alle Einstellungen gleich sind, einschließlich Abtastrate, Temperaturbereich, Rückkopplungsmodus, Vor-Scan-Thermostat.
- T_ms und DSC-Thermogramme können abhängig von Abtastrate und Rückkopplungsmodus sein.
Temperaturbereich: Scanbeginn 10-20°C unterhalb des 1^sten T_m, und Scanende 10-20°C über dem letzten T_m.
Abtastraten:
- Typische Abtastrate für Proteine und Nukleinsäuren ist 60 bis 90 °C/h
- Typische Abtastrate für Lipide ist 30 bis 60°C/h
- Für MicroCal PEAQ-DSC und VP-Capillary DSC verwenden Sie eine Abtastrate von 180 bis 240 °C/h um den Probendurchsatz während des T_m-Screenings zu erhöhen
Empfohlene „Rückkopplungsmodi“:
- Proteine – keiner oder niedrig
- DNA und RNA – niedrig oder mittel
- Lipide – hoch
Empfohlener „Vor-Scan-Thermostat“ von 3 bis 15 Minuten.

Für automatisierte MicroCal PEAQ-DSC und VP-Capillary DSC Systeme:

Stellen Sie sicher, dass die Proben vor der DSC-Analyse bei einer geeigneten Temperatur gelagert werden. Für Proteine und andere Biomoleküle, stellen Sie die Kühlstapftemperatur auf 5 bis 10°C ein. Wenn Sie ein thermostabiles Material untersuchen, können Sie den Kühlstapel auf 25°C einstellen.
Verwenden Sie mindestens drei Auswechsel-Befüllungen (auf dem VP-Capillary DSC als „number of filling strokes“ bezeichnet), um die DSC-Zellen von der 96 Well Platte zu befüllen.
Programmieren Sie Zellreinigungen mit 20% Contrad 70 oder 14% Decon 90.

DSC-Rohdaten-Qualität:

Führen Sie immer einen abgestimmten Puffer-Puffer-Scan (unter identischen Scan-Bedingungen) durch, um die Datenanalyse zu unterstützen. Bei Bedarf können Sie einen Puffer-Puffer-Scan vor jeder Probe durchführen.
Häufige Puffer-Puffer-Scans dienen als zusätzliche Instrumentenleistungsprüfung, um sicherzustellen, dass die DSC-Zellen sauber sind und das Instrument korrekt arbeitet.
Puffer-Puffer-Scans sollten durchgehend reproduzierbar sein (unter der Annahme gleicher DSC-Parameter).
Mit dem automatisierten PEAQ-DSC und seinen effizienten Waschpumpen und optimierten DSC-Zellreinigungsprotokollen ist es möglich, drei (oder mehr) Proben hintereinander durchzuführen, ohne zwischen den Puffer-Puffer-Scans zu laufen.
Der DP-Wert (in mcal/min) für das rohe DSC-Thermogramm sollte zu Beginn des Puffer-Puffer- oder Wasser-Wasser-Scans nahe null sein.
Zu Beginn der Proteinscans wird der DP-Wert normalerweise negativer verglichen mit abgestimmten Puffer-Puffer-Scans. Höhere Proteinkonzentrationen haben eine größere negative Auslenkung. Bei gutem Pufferabgleich sollte dieser DP-Unterschied etwa 0,15 bis 0,25 mcal/min für jedes 1 g/L Protein betragen (Abbildung 1).
Ist der DP-Unterschied zwischen Protein- und Puffer-Puffer-Scans größer als 1 mcal/min, kann dies auf ein Pufferfehlanpassung zwischen Protein und Puffer, eine verschmutzte Zelle, eine unterfüllte Zelle, Blasen in der Zelle oder konzentrierteres Protein zurückzuführen sein (Abbildung 2).