Wichtige Punkte bei der DSC (Differential Scanning Calorimetry) Messung von Proteinen und Biopolymeren

MicroCal PEAQ-DSC (Differential Scanning Calorimeter), ein Gerät zur Bewertung der Stabilität von Biomolekülen, vermittelt wichtige Punkte bei der DSC-Messung von Proteinen und Biopolymeren.

Was muss beachtet werden, um qualitativ hochwertige DSC-Daten zu erhalten? Wie ist der Zustand der Probe? Was sind die Messbedingungen? Lassen Sie uns die folgende Liste noch einmal durchgehen!

【Probenbedingungen】

Um qualitativ hochwertige DSC-Daten zu erhalten, sollten die folgenden Punkte eingehalten werden.

• Die Zusammensetzung der Pufferlösung in der Probenzelle und der Referenzzelle sollte übereinstimmen.
• Passen Sie die Probe durch Dialyse, Entsalzungssäulen oder andere Methoden so an, dass sie in die gewünschte Pufferlösung überführt wird.
• Bewahren Sie das bei der Pufferwechsel verwendete Dialysat und die Pufferlösung auf und verwenden Sie sie für die Referenzzellverwendung und Puffer-Puffer-Scans (nachfolgend Puffer-Scan).
• Die empfohlene Konzentration der Proteinprobe liegt bei 0,1–2 mg/mL.
• Der erhaltene T_m-Wert (denaturierende Mittelpunkttemperatur) in der DSC ist konzentrationsabhängig.
  Daher sollten bei T_m-Screening oder Äquivalenzprüfungen alle Probenkonzentrationen gleich sein.

【Einstellung der Messbedingungen】

• Bei T_m-Screening oder Äquivalenztests mit DSC müssen alle Messbedingungen (Scangeschwindigkeit, Temperaturbereich, Rückkoppelungsmodus, Vor-Scan-Thermostat usw.) identisch sein. Die Form des Thermogramms wird von der Scangeschwindigkeit und dem Rückkoppelungsmodus beeinflusst.
• Temperaturbereich: Die Anfangstemperatur sollte 10–20℃ niedriger als die Temperatur des ersten T_m-Wertes und die Endtemperatur 10–20℃ höher als die des letzten T_m-Wertes eingestellt werden.
• Scangeschwindigkeit (allgemeine Empfehlung)
  • Proteine, Nukleinsäuren: 60–90℃/h
  • Lipide: 30–90℃/h
  Um den Durchsatz beim T_m-Screening zu erhöhen, kann die Scangeschwindigkeit auf 180–240℃/h eingestellt werden (unterstützte Modelle: PEAQ-DSC, VP-Capillary DSC).
• Rückkoppelungsmodus
  • Proteine: keine oder niedrig
  • Nukleinsäuren: niedrig oder mittel
  • Lipide: hoch
• Vor-Scan-Thermostat: Empfehlung 3–15 Minuten.

【Hinweise für automatisierte Systeme mit Autosampler】

• Berücksichtigen Sie die Stabilität der Probe und lagern Sie sie bei geeigneter Temperatur. Bei Proteinen oder anderen biologischen Makromolekülen die Kühlung bei 5–10℃ einstellen. Wenn die Probe stabil ist, sind auch 25℃ akzeptabel.
• Purge/Refills (oder die Anzahl der Befüllungsstriche) sollten mindestens dreimal eingestellt werden.
• Integrieren Sie eine Reinigungsmethode mit 14% Decon90 (oder 20% Contrad70) in den Prozess.

【Qualität der Rohmessdaten】

• Proben- und Puffer-Scan sollten stets unter denselben Scan-Bedingungen durchgeführt werden. Bei Bedarf kann vor jedem einzelnen Proben-Scan ein Puffer-Scan durchgeführt werden.
• Durch häufiges Durchführen von Puffer-Scans lässt sich sicherstellen, dass die Zellen sauber sind und das Gerät ordnungsgemäß funktioniert.
• Wenn Messungen immer mit den gleichen Scan-Bedingungen durchgeführt werden, muss die Reproduzierbarkeit der Puffer-Scans hoch sein.
  (Bei PEAQ-DSC Automated sind effiziente Reinigungspumpen und optimierte Reinigungsprotokolle vorhanden. Es können bis zu drei Proben (oder mehr) ohne Puffer-Scan zwischen den Messungen gemessen werden.)
• Die Werte für DP bei Beginn des Puffer-Scans sowie beim Wasser-Wasser-Scan sollten nahezu null mcal/min betragen.
• Die DP-Werte bei Proteinscans sind im Vergleich zu Pufferscans negativ. Bei hohen Proteinkonzentrationen werden die negativen Werte stärker. Bei geringem Unterschied in der Pufferzusammensetzung beträgt die Abweichung zwischen Proben- und Puffer-Scan etwa 0,15–0,25 mcal/min bei einer Proteinkonzentration von 1 g/L. (Abbildung 1)

Wenn es eine Abweichung von mehr als 1 mcal/min zwischen Proben- und Puffer-Scan gibt, könnten folgende Gründe vorliegen. (Abbildung 2)

• Ein Missverhältnis zwischen der Probe und dem Puffer
• Verschmutzte Zelle
• Unzureichende Befüllung mit Lösung
• Gaseintritt
• Sehr hohe Probendichte