DSC und Proteinstabilität: Was bedeutet die Enthalpieänderung?

Differential Scanning Calorimetry (DSC) ist die einzige analytische Methode, die direkt die Enthalpieänderung (∆H) eines thermischen Übergangs misst, wie zum Beispiel die thermische Denaturierung eines Proteins, Nukleinsäure oder eines anderen Biopolymers.

Was ist ∆H?

∆H ist die Gesamtenergie, die aufgebracht wird, um das System bei konstantem Druck auf Temperatur T zu bringen. Für ein Protein bedeutet dies die Energie (Wärme), die aufgewendet wird, um es zu entfalten, und das ∆H ist positiv, was einen endothermen Prozess darstellt. Diese Energie ist mit allen atomaren und molekularen Bewegungen sowie mit der Energie der Bindungen verbunden, die das Protein in gefalteter Konformation halten. 

∆H wird durch Integration der Fläche unter dem Thermogramm berechnet (siehe Abbildung unten) und wird in Kalorien (oder Joule) pro Mol Protein dargestellt. Während das Protein während eines DSC-Experiments steigenden Temperaturen ausgesetzt wird, beginnt es, thermisch zu denaturieren, da die nicht-kovalenten Bindungen aufgebrochen werden. Das ∆H steht im Zusammenhang mit der Anzahl der Bindungen, die benötigt werden, um das Protein in seiner nativen (gefalteten) Konformation zu halten.

∆H hängt davon ab, wie genau wir die Gesamtproteinkonzentration messen. Wenn die Proteinkonzentration nicht genau bestimmt wird, wird der berechnete ∆H-Wert beeinflusst.

Was sagt uns der ∆H-Wert in der Praxis?

Wenn Sie die DSC-Ergebnisse verschiedener Proteine vergleichen, ist das Protein mit dem höheren ∆H-Wert nicht unbedingt stabiler als das mit dem niedrigeren ∆H. Da ∆H pro Gesamtmolaren Proteinkonzentration normalisiert ist, wird der Wert oft proportional zur Größe des Proteins sein. Die meisten Proteine haben die gleiche Bindungsdichte (Bindungen pro Volumen). Es ist vernünftig zu erwarten, dass ein Protein mit einem größeren Molekulargewicht auch ein größeres ∆H haben wird.

∆H ist abhängig vom Prozentsatz des nativen Proteins in Lösung

Ein wichtiger Aspekt ist, dass DSC nur den ∆H-Wert für Protein misst, das sich zunächst in seiner gefalteten (nativen) Konformation befindet. Die Größe von ∆H hängt von der Konzentration der gefalteten Fraktion ab. Wenn die initiale gefaltete Proteinkonzentration weniger als 100% der gesamten Proteinkonzentration beträgt, wird der berechnete ∆H-Wert entsprechend kleiner sein.

Die folgende Abbildung zeigt DSC-Thermogramme für dasselbe Protein, gemessen zu verschiedenen Zeiten während der Lagerung. Das blaue Thermogramm steht für frisch zubereitetes Protein, das zu 100% natives (gefaltetes) Protein ist. Während das Proteinmuster während der Lagerung verdirbt, beginnt der Anteil des nativen Proteins in der Lösung abzunehmen, was zu einer Abnahme der Enthalpie in den DSC-Thermogrammen führt. Wir können die relativen ∆H-Werte aus den verschiedenen Thermogrammen verwenden, um die gefaltete Proteinfraktion für jede Probe zu schätzen, wenn wir ein Referenz-DSC-Thermogramm mit 100% nativem Protein haben.

In diesem Beispiel hat das ∆H für die Probe mit dem grünen Thermogramm 50% des ∆H der blauen Probe, es handelt sich also um 50% gefaltetes Protein. Die orangefarbene Probe enthält 25% gefaltetes Protein, und die rote Probe hat 10% gefaltetes Protein, relativ zum blauen Thermogramm.

Kalorimetrische und van’t Hoff Enthalpien

Bislang haben wir in diesem Blog über die „kalorimetrische“ Enthalpie geschrieben, die direkt durch DSC gemessen wird und oft als ∆H_cal dargestellt wird. Es gibt eine andere Art von Enthalpie, die wir aus DSC-Daten berechnen können: die van’t Hoff Enthalpie – ∆H_vH. Dieser Wert ist aus dem DSC Non-Two-State-Modell-Fit verfügbar. ∆H_vH ist auch die Enthalpie, die aus jeder nicht-kalorimetrischen (indirekten) thermischen Schmelztechnik bestimmt wird, wie z.B. dem Kreisdichroismus.

Mit DSC wird ∆H_cal nur durch die Fläche unter einem Übergangspeak bestimmt, während ∆H_vH nur durch die Form des Übergangspeaks bestimmt wird. Je schärfer der Übergang, desto größer ist ∆H_vH und umgekehrt. ∆H_cal ist konzentrationsabhängig, aber ∆H_vH ist es nicht. 

Üblicherweise wird ein ∆H_cal /∆H_vH-Verhältnis von eins als Anzeichen dafür genommen, dass der untersuchte Übergang dem Zweizustands-Entfaltungsmechanismus entspricht. Ein ∆H_cal /∆H_vH-Verhältnis größer als eins deutet auf die Anwesenheit von signifikant bevölkerten Zwischenzuständen hin; und ein ∆H_cal /∆H_vH-Verhältnis kleiner als eins auf intermolekulare Wechselwirkungen.

Verwenden wir das ∆H_cal /∆H_vH, können wir schätzen, dass ein großer Teil des Proteins inaktiv ist. Wenn wir ein einfaches Ein-Domänen-Protein haben und keine Zwischenprodukte annehmen, kann erwartet werden, dass sein Entfaltungsprozess ein Verhältnis von ∆H_cal /∆H_vH nicht weit von eins haben wird. Ein deutlich niedrigeres ∆H_cal als das ∆H_vH kann darauf hinweisen, dass ein großer Teil des Proteins bereits inaktiv ist. 

Zusammenfassend kann die DSC-Analyse der ∆H-Daten Einblicke in den Entfaltungsmechanismus von Proteinen geben und wie viel Protein in seiner nativen Konformation vorliegt.

Weiterführende Literatur

• Differential Scanning Calorimetry (DSC): Theorie und Praxis
• Differential Scanning Calorimetry (DSC) für die biopharmazeutische Entwicklung: Vielseitigkeit und Stärke
• Die Kraft der Wärme: Mit Differential Scanning Calorimetry tiefere Einblicke in wichtige Proteineigenschaften gewinnen