Dynamische Lichtstreuung – Festgelegte gebräuchliche Begriffe

1. Z-Mittelwertgröße (Z-Average Size)

      Die in der dynamischen Lichtstreuung verwendete Z-Mittelwertgröße oder der Z-Mittelwert Median ist auch als kumulierter Median bekannt. Dies ist der wichtigste und stabilste Parameter, der mit der Methode erzeugt wird. Der Z-Mittelwert Median ist in ISO 13321 und neuer in ISO 22412 spezifiziert, sodass er den besten Wert für die Berichterstattung in Qualitätskontrollvorschriften darstellt, wenn ISO-Standards den Median als ‚harmonischen Intensitätsmittelwertpartikeldurchmesser‘ definieren.

  Die Z-Mittelwertgröße kann verglichen werden mit Größen, die durch andere Verfahren gemessen wurden, wenn die Probe eine Einzelsubstanz (d. h. nur einen Peak) darstellt, die in ihrer Form kugelförmig oder nahezu kugelförmig ist und einfach dispers (d. h. eine sehr enge Verteilung aufweist) ist, und wenn die Probe in einem geeigneten Dispergiermittel dispergiert ist. Der Grund dafür ist, dass die Z-Mittelwertgröße empfindlich auf geringe Änderungen in der Probe reagieren kann, wie etwa auf das Vorhandensein kleiner Mengen von Aggregaten. Z-Mittel ist ein hydrodynamischer Parameter, der nur auf Moleküle oder in Lösungen dispergierte Partikel anwendbar ist. 

2. Kumulantenanalyse

     Dies ist eine einfache Methode zur Analyse der durch DLS-Experimente erzeugten Autokorrelationsfunktion. Die Ausgabe ist in ISO 13321 und ISO 22412 geregelt. Es handelt sich um eine Momenterweiterung, wodurch viele Werte erzeugt werden können, aber nur die ersten beiden Terme tatsächlich verwendet werden.

  Das bedeutet, dass der Mittelwert der Größe (Z-Average) und der als Polydispersitätsindex (PdI) bekannte Breitenparameter diese Terme sind. Der Z-Mittelwert ist ein Signal-intensitätsbestimmter Wert und sollte nicht mit dem Mittelwert von Masse oder Anzahl in anderen Verfahren verwechselt oder direkt verglichen werden. Die Berechnung ist durch ISO-Normen geregelt. Daher sollten alle Systeme, die empfohlen wurden, diese Berechnung zu verwenden, vergleichbare Ergebnisse bei Verwendung desselben Streuwinkels liefern.

3. Polydispersitätsindex (Polydispersity Index)

     Dieser Index ist eine aus einer einfachen zweiparametrigen Anpassung an die Korrelationsdaten (Kumulantenanalyse) abgeleitete Zahl. Der Polydispersitätsindex ist dimensionslos und skaliert so, dass, abgesehen von hochgradig monodispersen Standardmaterialien, Werte unter 0.05 selten auftreten. Werte über 0.7 zeigen an, dass die Probe eine sehr verbreitete Verteilung hat und möglicherweise für die dynamische Lichtstreuungsmethode (DLS) ungeeignet ist.

  Verschiedene Größenverteilungsalgorithmen arbeiten mit Daten, die innerhalb dieser zwei Grenzen liegen. Die Berechnung dieser Parameter ist in den ISO-Standarddokumenten 13321:1996 E und ISO 22412:2008 spezifiziert.

4. Polydispersität (Polydispersity)

     In der Lichtstreuung wird die Polydispersität und der % Polydispersität aus dem Polydispersitätsindex abgeleitet, der ein Parameter ist, der aus der kumulanten Analyse der Autokorrelationsfunktion der durch DLS gemessenen Intensität gewonnen wird. In der kumulanten Analyse wird ein Einzelpartikelgrößenmodus angenommen und eine Einzelexponentialanpassung an die Autokorrelationsfunktion vorgenommen, während die Monodispersität die Breite der angenommenen Gaußverteilung beschreibt. Bei der Proteinanalytik weist eine Polydispersität von unter 20 % darauf hin, dass die Probe monodispers ist. 

5. Diffusionskoeffizient (Diffusion Coefficient)

     Partikel und Moleküle in Suspension oder Lösung zeigen Brown’sche Bewegung. Es handelt sich um Bewegungen, die infolge von thermischer Energie durch Stöße mit Lösungsmittelmolekülen verursacht werden. Wenn Partikel oder Moleküle von einem Laserlicht getroffen werden, variiert die Intensität des gestreuten Lichts abhängig von der Partikelgröße aufgrund der heftigeren Stöße, die kleinere Partikel durch Lösungsmittelmoleküle erfahren und daher schneller bewegt werden.

  Da man durch die Analyse dieser Intensitätsschwankungen die Geschwindigkeit der Brown’schen Bewegung ableiten kann, kann die Partikelgröße durch Anwendung der Stokes-Einstein-Gleichung ermittelt werden. Daher definiert der Diffusionskoeffizient die Brown’sche Bewegung eines Analyten oder Partikels in einer bestimmten Lösungsmittelumgebung. Dieser transiente Diffusionskoeffizient variiert basierend auf der Ionenkonzentration und Art im Medium sowie der Partikelgröße und Oberflächenstruktur.

5. Hydrodynamischer Durchmesser (Hydrodynamic diameter)

     Die durch die dynamische Lichtstreuung (DLS) gemessene hydrodynamische Größe wird als die Größe einer hypothetischen Kugel definiert, die auf die gleiche Weise wie das gemessene Partikel diffundiert. Tatsächlich sind die Partikel oder Makromoleküle in der Lösung jedoch nicht kugelförmig, dynamisch (Rotieren) und auch solvatisiert. Daher repräsentiert der durch die Diffusionsmerkmale des Partikels abgeleitete Durchmesser die scheinbare Größe der dynamisch solvatisierten/sollvatierten Partikel. Daher entstand der Begriff hydrodynamischer Durchmesser. Der hydrodynamische oder Stokes-Durchmesser beschreibt den Durchmesser einer Kugel, die bei einem gegebenen transzienten Diffusionskoeffizienten einen Wasser- oder Hydrathüller um das Partikel oder Molekül besitzt.

6. Korrelationskurve – oder Korrelationsfunktion

(Correlation Curve – or correlation function)

     Die in einem DLS-Experiment gemessenen Daten bestehen aus einer glatten, einzelgrößenpartikelverteilten exponenziellen Abklingfunktion der Korrelationskurve. Die Korrelationskurve enthält alle Informationen zur Partikeldiffusion in der gemessenen Probe. Indem die Korrelationskurve einer Exponentialfunktion angepasst wird, kann der Diffusionskoeffizient (D) berechnet werden (D verhält sich proportional zur gesamten Zeit der exponentiellen Abklingung).

  Sobald der Diffusionskoeffizient (D) bekannt ist, kann der hydrodynamische Durchmesser durch Verwendung einer modifizierten Stokes-Einstein-Gleichung berechnet werden. In polydispersen Proben ist diese Kurve der Summe exponentieller Zerfallsprozesse.

7. Y-Abschnitt oder Schnittpunkt (Y-Intercept or Intercept)

     In der DLS bezeichnet der Y-Abschnitt oder einfacher der Schnittpunkt den Schnittpunkt der Korrelationskurve auf der y-Achse des Korrelationsdiagramms. Der y-Schnittpunkt kann verwendet werden, um das Signal-zu-Rausch-Verhältnis der gemessenen Probe zu bewerten und wird häufig verwendet, um die Datenqualität zu beurteilen. Er wird so skaliert, dass idealerweise ein Signalwert von 1 erreicht wird, ein gutes System einen Abschnitt von über 0.6 und die besten Systeme einen Abschnitt von über 0.9 bieten.

8. Dekonvolution oder Dekonvolutionsalgorithmus

(Deconvolution or Deconvolution algorithm)

     Ein algorithmusbasiertes Verfahren zum Zerlegen der aus polydispersen Proben gewonnenen exponentiellen Mischungen in eine Vielzahl von Intensitätswerten im Zusammenhang mit individuellen Größenbändern. Die Partikelgrößenverteilung, die aus der dynamischen Lichtstreuung (DLS) gewonnen wird, basiert auf der Dekonvolution der Autokorrelationsfunktion der gemessenen Intensität der Probe. In der Regel erfolgt dies mithilfe eines nicht-negativen, durch die kleinsten Quadrate (NNLS) eingeschränkten Anpassungsalgorithmus (ein gebräuchliches Beispiel ist CONTIN).

9. Zählrate oder Photonenzählrate

(Count Rate or Photon Count Rate)

     In der DLS ist dies einfach die Anzahl der detektierten Photonen, die in der Regel als „pro Sekunde“ angegeben wird. Dies ist nützlich zur Bestimmung der Probenqualität durch Überwachung der Stabilität als Funktion der Zeit sowie zur Einstellung von Geräteparametern wie Dämpfung und Analysezeit. Für die Analyse sollte die Zählrate eine bestimmte Mindestmenge überschreiten, um ein ausreichendes Signal zu erhalten. Jedoch hat jeder Detektor eine maximale Zählrate, bei der die Reaktion linear bleibt. Wenn die Zählrate nicht automatisch kompensiert wird, sollten die Empfehlungen des Herstellers zur Anpassung der Zählrate befolgt werden.

10. Intensitätsverteilung (Intensity Distribution)

     Das primäre Ergebnis eines DLS-Experiments ist die Intensitätsverteilung der Partikelgrößen. Die Intensitätsverteilung wird natürlich durch die Streuintensität jedes Partikels oder Ensemblemitglieds gewichtet. Bei biologischen Materialien oder Polymeren ist die Streuintensität des Partikels proportional zum Quadrat der Molekularmasse. Daher kann die Intensitätsverteilung in dem Sinne irreführend sein, dass das Vorhandensein geringer Mengen an Aggregaten oder großen Partikelspezies die Verteilung dominiert. Trotzdem kann diese Verteilung als ein empfindlicher Indikator für das Vorhandensein größerer Bestandteile in der Probe verwendet werden.

11. Volumenverteilung (Volume Distribution)

     Die grundlegende Größenverteilung, die durch DLS erzeugt wird, ist eine Intensitätsverteilung, die jedoch in eine Volumenverteilung umgewandelt werden kann, die die relativen Anteile der verschiedenen Komponenten in der Probe beschreibt, indem sie auf Masse oder Volumen statt auf Streuintensität basiert, wie durch die Anwendung der Mie-Theorie gegeben.

  Bei der Umwandlung der Intensitätsverteilung in Volumen-/Masseverteilung müssen die folgenden vier Annahmen akzeptiert werden:

• Alle Partikel sollten sphärisch sein
• Alle Partikel sollten homogen sein
• Die optischen Eigenschaften der Partikel wie der tatsächliche und der komplexe Brechungsindex sollten bekannt sein
• Es sollte keine Fehler in der Intensitätsverteilung geben

  Das Verständnis dieser Annahmen ist besonders wichtig, da die DLS-Technik selbst eine intrinsische Vergrößerung

bei der Darstellung der Intensitätsverteilung ergibt, was immer zu gewissen Fehlern führt. Daher wird bei der Angabe der Intensitätsverteilung

immer einige Fehler auftreten. Somit sollten Intensitätsverteilungen, die durch Volumen- und Zahlverteilungen ergänzt werden, vor allem

zur Schätzung von relativen Anteilen verwendet werden, aber nicht unbedingt als

absolut angesehen werden. Deshalb werden Größenangaben von Peaks auf der Basis von Intensitätsanalysen gemessen. Es ist

best practice, lediglich relative Prozentsätze (anstelle von Größen) aus Volumenverteilungsanalysen zu berichten.