Auszug aus einem Buch: Wärmemengenbewertung molekularer Wechselwirkungen mit einem isothermen Titrationskalorimeter (ITC)

Experimentelle Medizin Sonderausgabe „Perfekte Interaktionsanalyse für die Wirkstoffforschung“ (Herausgegeben von der auf biowissenschaftliche und medizinische Themen spezialisierten Verlag Yodosha Ltd.) Kapitel 1: Standard der Interaktionsanalyse in der Arzneimittelentwicklung – I Niedermolekulare Arzneimittelentwicklung – 5 (verfasst von Akira Nagatoishi und Kōhei Tsumoto) stellt Artikel über ITC vor. Dieser Artikel wurde mit freundlicher Genehmigung von Yodosha Ltd. veröffentlicht.

Bewertung der Wärmemengen molekularer Wechselwirkungen mit einem isothermen Titrationskalorimeter (ITC)

Akira Nagatoishi, Kōhei Tsumoto

Ziel und Schwerpunkt des Experiments

Ein isothermes Titrationskalorimeter (ITC) ist ein Gerät, das die Wärmemengenänderung bei molekularen Wechselwirkungen detektiert. Durch die Beobachtung der Wärmemengenänderung bei molekularen Wechselwirkungen können die thermodynamischen Eigenschaften von nicht-kovalenten Bindungen direkt aufgezeigt werden. Dies ermöglicht es, Informationen über die Bindungsmodalitäten und Spezifitäten von durch das Screening ausgewählten Seed- und Hit-Verbindungen zu erhalten. Darüber hinaus kann die Wechselwirkung in der Struktur-Optimierung durch thermodynamische Parameter präzise analysiert werden, um festzustellen, ob die Interaktionen wie erwartet stattfinden. Durch die Kombination mit Strukturinformationen können Designrichtlinien überprüft und die nächste Designstrategie initiiert werden.

Einleitung

Bei der Entwicklung niedrigmolekularer Arzneimittel ist die spezifische Interaktionsweise der Bindung von kleinen Molekülen an Proteine ein Schlüssel. Daher ist es wichtig, zu jedem Schritt der Erkundung, Validierung und Optimierung spezifische Erkenntnisse zu erlangen. Nicht-kovalente Bindungen zwischen Molekülen, Änderungen der Proteinstruktur oder -konformation und Änderungen des Hydrationszustands aufgrund der wässrigen Umgebung führen alle zu exothermen und endothermen Reaktionen. Daher bieten Wärmemessverfahren wichtige Indikatoren für die Analyse der Wechselwirkungen der Zielmoleküle. Das isotherme Titrationskalorimeter (ITC) ist das einzige analytische Verfahren zur Beobachtung der zu detektierenden Wärmemengenänderungen bei Wechselwirkungen und bietet hochpräzise thermodynamische Analysen. Informationen zur grundsätzlichen Verwendung von ITC finden Sie in Kapitel 1-13.

Optimierung: Die Validierung bestätigt die Spezifität für das Zielprotein und ein Hit wird etabliert. Von dieser Hit-Verbindung aus wird die Erweiterung des Gerüsts sowie das Hinzufügen/Verbessern von funktionellen Gruppen durchgeführt, um die Bindungsaffinität und funktionelle Aktivität zu erhöhen. Diese Strukturentwicklung wird Optimierung genannt.

In der Optimierung niedermolekularer Arzneimittel werden bedeutende retrospektive Studien zu thermodynamischem Wissen vorgestellt. In Abbildung 1A sind die thermodynamischen Parameter für HIV-Protease-Hemmer, antiretrovirale Medikamente zur AIDS-Behandlung, dargestellt^{1, 2}). In dieser Abbildung sind die Hemmstoffe, die in den 10 Jahren nach der Zulassung des ursprünglichen IDV im Jahr 1996 entwickelt wurden, in der Reihenfolge ihrer Zulassung aufgelistet. Mit der Zulassung neuer Hemmstoffe nimmt die Bindungsaffinität zu den Zielproteinen zu (negative Zunahme von ΔG). Bemerkenswert ist das thermodynamische Profil (Abbildung 1B).

Frühe Medikamente (z.B. IDV) waren entropiegetrieben mit ungünstiger Bindungsenthalpie (ΔH) und günstiger Bindungsentropie (ΔS). Mit der Optimierung der Medikamente hat sich das thermodynamische Gleichgewicht von entropiegetriebener zu enthalpiegetriebener Balance verändert (Abbildung 1B). Während in frühen Inhibitoren die entropische Komponente hoch ist, ist die Beitrag zur Enthalpie bei neuen, zugelassenen Inhibitoren stark. Darüber hinaus kann auch der Zusammenhang von ΔH–ΔS festgestellt werden. Ähnliche Trends sind bei HMG-CoA-Reduktasehemmern wie Statinen und Bisphosphonat-Präparaten zur Osteoporosebehandlung zu beobachten ^{3, 4}). Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass hohe Spezifität gegenüber dem Zielprotein – mit Beiträgen aus sowohl enthalpie- als auch entropiegetriebenen Ansätzen – bei der Optimierung von Medikamenten von entscheidender Bedeutung ist. Das Verstehen der thermodynamischen Beiträge von funktionellen Gruppen in der Strukturverbesserung eröffnet tiefere Einblicke in die Qualität von molekular zielgerichteten Therapien. Es ist schwierig, eine allgemeine Aussage darüber zu treffen, welche funktionellen Gruppen zur Enthalpie oder Entropie beitragen, aber die Validierung thermodynamischer Parameter und das rationale Design von Medikamenten bieten wichtige Informationen für die spezifische Gestaltung von niedermolekularen Konstruktionen gegen Zielproteine.

Vorbereitung

Grundlegende Vorbereitungsmethoden finden Sie in Kapitel 1-13. Beim Einsatz von Verbindungen, die häufig DMSO enthalten, sollte bei der Zubereitung darauf geachtet werden, keine Schwankungen in der Konzentration zu verursachen.

Protokoll

Grundlegende Operationen und experimentelle Verfahren finden Sie in Kapitel 1-13. Im Allgemeinen ist es ratsam, das Protein auf der Zellenseite und die Verbindung auf der Spritzen-Seite zu platzieren.

Problembehandlung

Achten Sie auf Wärmemengenänderungen durch DMSO
Beim Einsatz von Verbindungen, die häufig Assaysysteme mit DMSO enthalten, können unerwartet große Reaktionswärmen oder Verdünnungswärmen beobachtet werden. Ebenso wie bei SPR beeinflusst DMSO die Wärmemengen der Wechselwirkung bei ITC. Da die Probenvorbereitung auf der Zellenseite und auf der Spritzenseite separat durchgeführt werden muss, ist darauf zu achten, dass die DMSO-Konzentration nicht variiert. Bereits geringe Abweichungen in der DMSO-Konzentration können als Verdünnungsenthalpie beobachtet werden und die zu messenden Wechselwirkungswärmen überdecken. Eine Verdünnungsenthalpiemessung sollte daher kombiniert mit gefasst zielgerichteten Probenvorbereitungen durchgeführt werden, um Wärmeänderungen aus DMSO auf ein Minimum zu reduzieren.

Experiment Beispiel 1: Erkundung mit einem Wettbewerbsaussageverfahren unter Einsatz von ITC^5）

Um niedermolekulare Verbindungen zu finden, die spezifisch an Zielproteine binden, ist die umfassende Untersuchung der chemischen Räume auf der Proteinoberfläche eine effiziente und effektive Screening-Methode. Der Fokus liegt dabei auf der Strategie, mit einer Fragmentbibliothek von Molekülen unter 300 Da, verglichen mit der durchschnittlichen Molekülmasse herkömmlicher Verbindungsbibliotheken. Aufgrund der einfachen chemischen Struktur von Fragmentverbindungen ist die Bindungsaffinität zu Proteinen relativ gering, was zu Dissoziationskonstanten im mM-Bereich führen kann. In Analysen mit hoher Sensitivität und physikalisch-chemischen Analysemethoden ist ITC als bewertungswirksam bekannt. Wie im Beispiel der HIV-Protease-Inhibitoren beschrieben, wird bei spezifischen Bindungen häufig eine bedeutende exotherme Reaktionskonvergenz beobachtet. Ein solches Profil ist in der Regel mit der Bildung von Wasserstoffbrücken verbunden. Bei unspezifischen Interaktionen hingegen konvergieren die Reaktionsenthalpien nicht, und bei hydrophoben Wechselwirkungen werden endotherme Reaktionen beobachtet. Daher ist es ratsam, in der Trefferfindung Verbindungen, die exotherme Reaktionen zeigen, als potenziell wertvoll zu priorisieren. Wenn bei einem Zielprotein klar definierte Bindungsstellen bekannt sind und Substrate oder niedermolekulare Liganden bekannt sind, die an diese Bindungsstellen binden, ist ein kompetitiver Versuch eine wirksame Strategie. Durch den Einsatz von ITC für Konkurrenzassays können Hitrate-Verbindungen in spezifisch-reaktionsspezifischen Energieänderungen selektiert werden (Abbildung 2). Nachfolgend wird ein spezielles Beispiel beschrieben, das von den Autoren durchgeführt wurde.

1. Zielprotein

Ziel ist das Protein Ketosteroid-Isomerase (KSI) und 3-Oxosteroid-Δ5-Isomerase, ein Enzym, das die Isomerisierung von 3-Oxo-Δ5-Steroid in bioaktive konjugierte Isomere katalysiert.

2. Erkundung von niedermolekularen Verbindungen

Eine Fragmentbibliothek wurde mithilfe von SPR-Screening auf KSI durchsucht, um Verbindungen auszuwählen.

3. ITC-Konkurrenz-Assay (SITE)

Für die aus dem Screening gewonnenen potenziellen Trefferverbindungen wurde ein effizienter Fortschritt durch ein ITC-Konkurrenzassay durchgeführt. Diese Analysetechnik setzt sich durch das gleichzeitige Vorhandensein des Zielproteins und der Screening-Verbindungen im Lösungssystem ein, indem bekannte Ligandenmoleküle eingetropft werden (Abbildung 2A). Wenn die Fragmentverbindung auf der gewünschten Bindungsstelle von KSI interagiert, wird durch das Hinzufügen eines bekannten Liganden (Deoxycholat: DOC) als positive Kontrollverbindung die Fragmentverbindung verdrängt und auf die Bindungsstelle stabilisiert. Bei einer Wechselwirkung des Fragments mit einer exothermen Reaktion wird die Dissoziation der Fragmentverbindung bei DOC-Ablagerung als endotherme Reaktion beobachtet.

Um die Durchsatzkapazität zu steigern, wurde das SITE-Verfahren (single-injection thermal extinction) entwickelt, mit dem Wettbewerbsassays in einem einzigen Tropfen bewertet werden können. Mit der SITE-Methode wurde die Treffer-Validierung der Fragmentverbindung mit KSI durchgeführt. Konkret wurde ein enthalpiegetriebenes Profil identifiziert, das mit dem KSI-Substrat DOC konkurriert und eine energiereiche exotherme Reaktion zeigt (Abbildung 2B). Darüber hinaus wurde erfolgreich festgestellt, dass die zielgerichteten Kinaseproteine in der MAPK-Molekülkaskade, darunter ERK2, ebenfalls Verbindungstreffer durch Fragment-Screening erzielen können.

ITC leistet nicht nur bei der Optimierung von Medikamenten, sondern auch schon in der Entdeckungsphase beeindruckende Arbeit bei der thermalen Leistungsbewertung. Allgemein wird angenommen, dass exotherme Wechselwirkungen, die bei nicht-kovalenten Wechselwirkungen auftreten, typische Signalisierungsmerkmale von neu qualifizierten Wasserstoffbrücken zeigen. Rationales Design von Wasserstoffbrücken ist jedoch eine Herausforderung. Am Anfang des Medikamentenentwicklungsprozesses nützliche Informationen über niedermolekulare Verbindungen mit Wasserstoffbrücken und deren Synthese zu erhalten, ist eine wertvolle Methode zur Entwicklung hochwertiger Führungsverbindungen (leads).

Experiment Beispiel 2: ITC-Analyse bei der Optimierung von niedermolekularen Verbindungen^6）

1. Zielprotein

Ziel ist das in der Entstehung von Parkinson und Krebs stark beschuldigte Protein DJ-1 (Abbildung 3A). DJ-1 ist als Enzym bekannt, das glioxalspezifisch und ein effizientes Enzym darstellt, jedoch bleibt die Korrelation dieser Enzymaktivität mit der Krankheit noch weitgehend unbekannt. Daher wird das Vorhaben, Verbindungen zu bekommen, die die Enzymaktivität von DJ-1 hemmen, als Weg zur Aufdeckung dieser Zusammenhänge und als potentieller Beitrag zur neuen Therapieentwicklung betrachtet.

2. Exploration niedermolekularer Verbindungen

Eine Reihe von Verbindungen wurde bei einem SPR-Screening identifiziert. Eine von ihnen enthielt das Isatin-Gerüst und wurde als wertvoller Treffer hervorgehoben (Abbildung 3B).

3. Treffer-Validierung (ITC)

Bei der Validierungskandidatenverbindung durch ITC konnte nachgewiesen werden, dass Isatin eine bindungsstarke exotherme Reaktion zeigt, gezeigt im enthalpischen Profil (ΔH=−11,6 kcal/mol, –TΔS=4,1 kcal/mol, K_D = 3,2 μM) (Abbildung 3C). ΔG wird aus der Formel ΔG=ΔH−TΔS und K_D aus der Formel K_A=1/K_D berechnet. Durch Differential Scanning Fluorimetry (DSF) für die thermische Stabilität von DJ-1 wurde ebenfalls gezeigt, dass Isatin die thermische Stabilität von DJ-1 erhöht.

4. Strukturaufklärung

Die Kristallstrukturaufklärung von Komplexen zwischen Isatin und DJ-1 zeigte, dass Isatin kovalente sowie nicht-kovalente Bindungen zu mehreren Aminosäureseitenketten eingeht und eine einzigartige Komplexstruktur in Bindung mit DJ-1 darstellt (Abbildungen 4A,B). Durch Mutationsanalysen basierend auf diesen Strukturinformationen konnte gezeigt werden, dass Isatin in Lösungsmitteln mit DJ-1 dieselben Bindungsstellen aufweist wie in den Kristallstrukturen (Abbildung 4C).

5. Optimierung der Verbindungen

Basierend auf diesen Strukturinformationen wurde versucht, die Affinität der Verbindungen zu verbessern. Letztendlich gelang es, durch Verbindung #15 eine Bindungsaffinität im nM-Bereich zu erreichen (Abbildung 5). Verbindung #15 zeigte einen Beitrag zur Entropie (ΔH = -11,5 kcal/mol, –TΔS = 2,0 kcal/mol,K_D = 0,1 μM). Auch diese Verbindung verbesserte die Stabilität von DJ-1. Hinsichtlich der hemmenden Aktivität in der Zelle wurde diese Hit-Verbindung in Verbindung mit Isatin weiter untersucht. Letztendlich wurde gezeigt, dass sowohl Isatin als auch Verbindung #15 die Glioxalaktivität in Zellen unterdrücken können. Bemerkenswerterweise zeigten diese Verbindungen durch den zellbasierten Thermoverschiebungsassay (CETSA) eine signifikante thermische Stabilitätssteigerung von DJ-1 in den Zellen. Zusammenfassend zeigen die Ergebnisse, dass ITC-Validierungen entropiegetriebene Verbindungen für die Effizienzsteigerung selektieren können und, dass Strukturdesign den entropischen Beitrag zur Komplementierung leisten kann. Ansätze mit ITC sind somit wertvoll für die Selektion spezifisch auf das Zielprotein einwirkender Verbindungen in zellulären Kontexten.

Schlussfolgerung

In diesem Kapitel wurden Beispiele für die Entwicklung von niedermolekularen Arzneimitteln unter Anwendung von Wärmemessungen vorgestellt. In der Erforschung niedrigmolekularer Inhibitoren sind hohe biologische Aktivität, hemmende Wirksamkeit und hohe Bindungsaffinität als Auswahlindikatoren im Allgemeinen verbreitet. Der Fortschritt wird jedoch oft erfolglos ermöglicht, ohne dass die Art der Interaktionsweise zwischen dem Zielmolekül und dem niedermolekularen Medikament klar ist, was zu Problemen bei der Konzeptentwicklung und suboptimaler Struktur-Wirkungs-Beziehung bei der Struktur-Optimierung führen kann. Des Weiteren gehören zu den heutigen Zielmolekülen nicht nur Enzyme und Rezeptoren, sondern oft auch schwer handhabbare biochemische Ziele wie Membran- oder natürlich veränderte Proteine. Die Umgang mit potenziellen Zielen erweist sich als unweigerlich komplexer. Wenn es um schwierige Zielmoleküle geht, sind gängige Medikamentenerkundungsstrategien häufig hilflos. Auch zeigt es sich, dass Inhibitoren nicht unbedingt deutliche Bindungsstellen aufweisen und möglicherweise an Schnittstellen von Protein-Protein-Interaktionen (PPI) oder großen Protein-Komplexen binden müssen. In solchen Fällen ist eine Technologie, die hochsensitiv und quantitativ Bindungsverhalten analysieren kann, unabdingbar. Vor diesem Hintergrund stellt die Schaffung eines strategisch entwickelnden niedermolekularen Arzneimittels eine große Herausforderung dar. Die Notwendigkeit der präzisesten Explorations- und Analysetechnologien ist unerlässlich; eine dieser Technologien ist ITC, deren Nutzen in diesem Kapitel beschrieben wurde. In diesem Kapitel nicht angesprochen, aber von den Autoren andere durchgeführte Anwendungen von ITC in der niedermolekularen Inhibitorenerforschung beziehen sich auf Malaria und Krebszielattaque durch SHMT, wobei zwei unterschiedliche Verbindungen als enthalpiegetriebenes und entropiegetriebenes Schlagzeilenverbindung identifiziert wurden⁷. ITC-Wärmeprofile könnten möglicherweise als nützliche Methode für die Feststellung von Treffereigenschaften und rationales molekulares Design in der Struktur-Optimierung Einsatz finden.

◆ Literaturverzeichnis
1) Ohtaka H & Freire E: Prog Biophys Mol Biol, 88:193-208, 2005
2) Muzammil S et al.: J Virol, 81:5144-5154, 2007
3) Carbonell T & Freire E: Biochemistry, 44:11741-11748, 2005
4) Kawasaki Y et al.: Chem Pharm Bull (Tokyo), 62:77-83, 2014
5) Kobe A et al.: J Med Chem, 56:2155-2159, 2013
6) Tashiro S et al.: ACS Chem Biol, 13:2783-2793, 2018
7) Nonaka H et al.: Nat Commun, 10:876, 2019

Isothermes Titrationskalorimeter (ITC) der Malvern Panalytical
MicroCal ITC-Serie hier